הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית
Summary
באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.
Abstract
הובלה אקסונלית שומרת על הומאוסטזיס עצבי בכך שהיא מאפשרת סחר דו-כיווני של אברונים ומטענים מגוונים. לשיבושים בהובלה אקסונאלית יש השלכות הרסניות על נוירונים בודדים ועל הרשתות שלהם, והם תורמים לשפע של הפרעות נוירולוגיות. מכיוון שרבים מהמצבים האלה מערבים הן מנגנונים אוטונומיים של תאים והן מנגנונים לא-אוטונומיים, ולעתים קרובות מציגים ספקטרום של פתולוגיה על פני תת-סוגים עצביים, שיטות לזיהוי וניתוח מדויק של תת-קבוצות נוירונים הן הכרחיות.
מאמר זה מפרט פרוטוקולים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בעצבים סיאטיים של עכברים מורדמים. הוראות Stepwise ניתנות ל-1) להבחין בין מנוע לנוירונים חושיים in vivo, in situ ו-ex vivo על ידי שימוש בעכברים המבטאים באופן סלקטיבי חלבונים פלואורסצנטיים בתוך נוירונים מוטוריים כולינרגיים; ו-2) להעריך בנפרד או במקביל את ההובלה האקסונלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה. גישות תוך-ויטליות משלימות אלה מאפשרות הדמיה סימולטנית של מטענים שונים באקסונים עצביים היקפיים מובחנים כדי לנטר באופן כמותי הובלה אקסונאלית בבריאות ובמחלות.
Introduction
מערכת העצבים ההיקפית (PNS) מחברת את מערכת העצבים המרכזית (CNS) למטרות הדיסטליות שלה, ומאפשרת לממסר של אותות efferent להפעיל שליטה מוטורית ואותות afferent כדי לספק משוב חושי. באמצעות שלל ההתקדמות בגנטיקה של עכברים, מדענים פיתחו מודלים שונים של עכברים כדי לחקור מחלות/תסמונות רבות הפוגעות ב-PNS 1,2,3. מכיוון שרוב הפתולוגיות הנוירודגנרטיביות הן מולטי-פקטוריאליות עם תרומות אוטונומיות של תאים ולא אוטונומיים 4,5, התרת סבך של פתולוגיות ספציפיות לתאים/נוירונים יכולה לספק תובנות חיוניות וחדשניות על מנגנוני המחלה.
לשם כך, התפתחותם של עכברים מלאכותיים חיידקיים (BAC) – עכברים מהונדסים6 אפשרה ביטוי אנדוגני סלקטיבי של חלבונים פלואורסצנטיים בתת-קבוצות ממוקדות של תאי עצב. לדוגמה, עכברים מהונדסים BAC זמינים, המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתאי עצב כולינרגיים7 או גליצינרגיים8, או חלבון פלואורסצנטי אדום משתנה (tdTomato) בתאי עצב חיוביים פרוואלבומין9. לחלופין, ביטוי עצבי סלקטיבי של חלבונים פלואורסצנטיים יכול להיות מושג באמצעות טכנולוגיית Cre-loxP 10. לדוגמה, זני עכברים המבטאים Cre-recombinase בתת-קבוצות של תאי עצב (למשל, כולין אצטילטרנספראז (ChAT)-Cre) יכולים להיות מגודלים עם עכברים המבטאים חלבון פלואורסצנטי (למשל, tdTomato או GFP) מתוך לוקוס מכונן (למשל, Gt(ROSA)26Sor) תחת שליטתו של מדכא שעתוק לצד אתרי loxP11 (למשל, יצירת עכברים המבטאים tdTomato רק בתאי עצב כולינרגיים). ואכן, באמצעות רקומבינציה של Cre-loxP, נוצרו עכברים מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי צהוב באקסונים של מערכת קורטיקוספינל יורדת12.
בנוסף, ההתקדמות האחרונה בעריכת גנים CRISPR/Cas9, כגון ORANGE, מאפשרת תיוג פלואורסצנטי של מספר חלבונים עצביים אנדוגניים, כאשר הביטוי ניתן להשגה ברזולוציהננומטרית 13. יתר על כן, בשילוב עם זני עכברים המבטאים Cre, ניתן להשתמש ב-ORANGE-CAKE כדי לתייג מספר חלבונים אנדוגניים בתאי עצב בודדים13. לחלופין, מעקב עצבי בתיווך נגיפי מאפשר גם תיוג של תת-קבוצות נוירונים וניתן להשיגו באמצעות שילובים ממוקדים של סרוטיפים נגיפיים ו/או מקדמים ספציפיים לתא 14,15,16,17.
בהמשך לשיטות הסימון העצבי, קווי עכברים הונדסו גם כדי לבטא חלבונים מדווחים המכוונים לאברונים ספציפיים, כגון מיטוכונדריה המבטאת חלבון פלואורסצנטי ציאן (Mito.CFP)18 או אוטופגוזומים המבטאים GFP (LC3.GFP)19. יתר על כן, קווי עכברים הונדסו כדי להעריך את הדינמיקה של הסידן באופן ספציפי בתאי עצב (למשל, Thy1.GCaMP)20,21. בסך הכל, עם התקדמותם של מודלים כאלה, יישומים ניסיוניים חדשניים מאפשרים למדענים לשאול שאלות ביולוגיות ופתולוגיות מדויקות יותר על מערכת העצבים המרכזית וה-PNS.
התפקיד העיקרי של עצבים מוטוריים היקפיים הוא להעביר אותות חשמליים לשרירי השלד כדי לעורר תנועה. בנוסף, ומתרחשים על פני סקאלות זמן ארוכות יותר, מסרים נוירוכימיים ופיזיולוגיים בצורה של אברונים מגוונים (למשל, מיטוכונדריה, אנדוליזוזומים, אנדוזומים מאותתים) חוצים את הרשת הציטוסקית באופן חד-כיווני או דו-כיווני כדי לסייע בשמירה על הומאוסטזיס עצבי 22,23,24. לליקויים בהובלה אקסונאלית יש השלכות הרסניות על בריאות העצבים והם קשורים למחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות רבות25. ברמה המולקולרית, ליקויים בהובלה אקסונאלית יכולים לשבש אירועים פיזיולוגיים המווסתים איתות סינפטי ופלסטיות, שעתוק גנים ותרגום מקומי לאורך האקסון26,27. בעוד שיש שפע של כלים לחקר אירועים אלה בתאים/נוירונים בתרבית28,29, הערכת דינמיקת הובלה אקסונאלית ואירועים ביולוגיים הקשורים לאקסונאליים in vivo נדרשים כדי לאשר תובנות מפתח לגבי תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים30.
במהלך השנים, מעבדת Schiavo ביצעה אופטימיזציה של פרוטוקולים כדי לשאול שאלות מגוונות עלהובלה אקסונאלית 31,32,33,34,35,36. ניסויים אלה התרחבו מהתגלית כי קטע אטאוקסי מסומן פלואורסצנטי של טטנוס נוירוטוקסין (HCT) מופנם לתוך מסופי אקסון בשרירי השלד באמצעות אינטראקציות עם נידוגנים ופוליסילוגנגליוסיידים37. לאחר ההפנמה, HCT מועבר באופן רטרוגרדי באנדוזומים בעלי איתות חיוביים ל-Rab7, המכילים נוירוטרופין, המיועדים לגופי התאים של תאי העצב המוטוריים והחושיים 38,39,40,41. במקביל, ההתקדמות בטכנולוגיית ההדמיה אפשרה ניתוח בזמן אמת של צרורות עצבים היקפיים ואקסונים בודדים בעכברים חיים ומורדמים30. הבדיקה הראשונה להערכת דינמיקת הובלה אקסונאלית in vivo בפתולוגיה גילתה ליקויים קדם-סימפטומטיים בהעברת אנדוזומים ומיטוכונדריה באיתות במודל העכבר SOD1G93A של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS)35. חשוב לציין כי פגמים אלה לא צפויים לייצג רק השלכות משניות של ניוון עצבי, בהתחשב בממצא כי אובדן נוירונים מוטוריים יכול להתרחש בהיעדר הפרעות הובלה אקסונאליות במודל עכבר של מחלת קנדי42 ומודל FUS מוטנטי הטרוזיגוטי של ALS43. ליקויי הובלה אקסונאליים כאלה ניתנים לתיקון בעכברי ALS באמצעות מעכבים של קינאזות ספציפיות33 או קולטני גורם גדילה34. יתר על כן, טיפול בתאי עצב עם חוסם היסטון דאצטילאז מסוים משנה את ההובלה המיטוכונדרית in vivo36. לאחרונה, אנו מדווחים כי המודולציה התלויה ב-BDNF של הובלה אקסונאלית אינה מווסתת בתת-סוגים שונים של נוירונים מוטוריים בעכברי ALS44.
על ידי שימוש בערכת כלים הולכת ומתרחבת להערכת דינמיקת הובלה אקסונאלית28,29, פרוטוקול וידאו זה מתאר מספר יישומים שיאפשרו תובנות נוספות לגבי תרחישים ביולוגיים ופתולוגיים שונים. ראשית, עכברים מהונדסים המבטאים באופן סלקטיבי חלבונים פלואורסצנטיים בתאי עצב כולינרגיים (כלומר, נוירונים מוטוריים) משמשים להבחנה בין אקסונים מוטוריים וחושיים הן in vivo והן ex vivo. לאחר מכן, HCT המסומן באופן פלואורסצנטי נטען לאיתות על אנדוזומים בשלושה קווים מהונדסים כדי להבדיל בין דינמיקת הובלה אקסונאלית בנוירונים היקפיים מובחנים. פרוטוקול הניסוי הבא מפרט גישה פלואורסצנטית מולטיפלקסית להערכת הובלה מיטוכונדריאלית במיוחד בתאי עצב מוטוריים על ידי גידול עכברי ChAT.tdTomato עם עכברי Mito-CFP. לבסוף, ניתנות הוראות כיצד לדמות במקביל מיטוכונדריה ולאיתות אנדוזומים בתוך אותו אקסון in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מפרט שלבים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים ומיטוכונדריה מאותתים באקסונים שלמים של העצב הסיאטי של העכבר. ואכן, מסופקת התקנה ניסיונית המאפשרת למשתמשים 1) להבחין בין נוירונים מוטוריים לנוירונים חושיים in vivo, in situ ו – ex vivo על ידי שימוש בעכברים המבטאים חלבוני דיווח פלואורסצנטיים המתבטאים באופן סלקטיבי בתאי עצב מוטוריים; 2) להעריך הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים מאותתים במיוחד באקסונים של נוירונים מוטוריים באמצעות שלושה עכברים מהונדסים שונים; 3) לחקור הובלה אקסונאלית in vivo של מיטוכונדריה במיוחד באקסונים של נוירונים מוטוריים; ו-4) להעריך בו-זמנית את דינמיקת ההובלה של in vivo של איתות אנדוזומים ומיטוכונדריה בתוך אותו אקסון. לגישה זו יש פוטנציאל עצום לחקר הובלה אקסונאלית בתנאים בסיסיים וניתן להשתמש בה כדי להעריך הפרעות פתולוגיות במחלות שונות המשפיעות על מוטוריקה היקפית ועצבים חושיים.
תוך שימוש בפרדיגמות ניסיוניות קודמות כבסיס 31,32, יש לנו כאן דרכים חדשניות וחזקות מפורטות להבדיל בין הובלה אקסונאלית המתרחשת בתאי עצב מוטוריים לעומת נוירונים חושיים באמצעות עכברי דיווח מהונדסים. באמצעות עכבר Mito.CFP, גישה זו פותחה עוד יותר כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלית in vivo על ידי הימנעות מזריקות עצבים תוך-סיאטיות של TMRE36. זה עוקף נזק עצבי אפשרי והפרעות בהובלה אקסונלית הנגרמת על ידי הזרקה תוך-עצבית של הגשושית. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הובלה אקסונלית של אברונים מרובים באקסונים מוטוריים תוך הפנמה של שרירים בעלי תכונות פיזיולוגיות מובהקות (למשל, שרירים בעלי עוויתות מהירות לעומת שרירים עמידים לעייפות בעוויתות איטיות). לפיכך, ניתן להעריך את דינמיקת ההובלה האקסונאלית של האנדוזומים ו/או המיטוכונדריה בתת-קבוצות שונות של נוירונים α-מוטוריים44. יתר על כן, ההובלה האקסונלית של אותם אברונים במסגרות פתולוגיות יכולה להיות מוערכת גם באמצעות crossbreeding עם מודלים של עכברים של מחלות נוירודגנרטיביות שונות 1,2,3.
ערכת כלי ההובלה האקסונאלית מתרחבת ללא הרף28,29, ופרוטוקולי ex vivo פותחו כדי להעריך את דינמיקת ההובלה באמצעות פורצי קרן גחון עכבר מתורבתים49 או תכשירי עצב-שריר עכבר נכרתים50. יתר על כן, פיתוח פרוטוקולים להערכת הובלה אקסונאלית בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושרים (hiPSC) שמקורם בתאי עצב שמקורם בקליפת המוח51 או בתאי עצב מוטוריים שמקורם ב-HIPSC בעמוד השדרה52 אפשרה חקירה של נוירונים אנושיים עם מוטציות הגורמות למחלות. פרוטוקולים חדשניים כאלה ברקמת עכבר ובתאים אנושיים יכולים לספק תובנות קריטיות על תפקוד עצבי, להקל על גילוי פתומכניסטי חדשני במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות, ולהשתמש בהם כדי לבחון מולקולות ואסטרטגיות טיפוליות.
יש לעקוב אחר מספר שלבים קריטיים ליישום מוצלח של טכניקות אלה, וכמה הערות חשובות סופקו בסעיף הפרוטוקול. הדרישות העיקריות להדמיה תוך-ורידית הן מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם החדרת במה מותאמת אישית והציוד לשמירה על הרדמה וטמפרטורה אופטימלית. ואכן, יש צורך במערכת הרדמה ניידת מיוחדת עבור 1) אינדוקציה של הרדמה, 2) דיסקציה/ עיבוד רקמות (כלומר, חשיפת העצב הסיאטי), ו-3) שמירה על הרדמה במהלך הדמיה תוך-ורידית (כפי שפורט קודם לכן ב-31,32). במיוחד כאשר משתמשים במטרות הגדלה גבוהות יותר (למשל, פי 40 או 63x), עומק ההרדמה יכול להשפיע על איכות התמונה, שכן הרדמה עמוקה יותר גורמת לנשימות ‘גזיות’ גדולות שגורמות לשינויים תכופים במיקוד. תנועות גדולות כאלה ישפיעו ללא ספק על ניתוחי הובלה לאחר ההדמיה (למשל, מעקב אחר מטענים באמצעות התוספים של פיג’י TrackMate53 או KymoAnalyzer54) מכיוון שתנועות הנשימה מייצרות ממצאים בסרטונים בהילוך מהיר שיכולים להפוך אותם ללא מתאימים למעקב אוטומטי או דורשים הערכה גוזלת זמן רב יותר. יתר על כן, ראינו גם ממצאי הדמיה הנגרמים על ידי עורקים פועמים בתוך העצב הסיאטי, אשר ניתן לפתור רק על ידי בחירת אזור הדמיה אחר. המיקרוסקופ חייב להיות מצויד בתא סביבתי המסוגל לשמור על טמפרטורת גוף קבועה, שכן הטמפרטורה וה- pH משפיעים על הובלה אקסונלית55. יתר על כן, יש להימנע מיישום של משככי כאבים לאחר הניתוח, שכן הם יכולים לשנות את דינמיקת ההובלה56. אם תכנון הניסוי הוא אורכי ודורש הדמיה חוזרת (למשל, 57), פרוטוקולי הנתיחה צריכים להיות מותאמים כראוי כך שיהיו זעיר פולשניים ועשויים לדרוש אישור אתי/רישיון נוסף.
יש לזכור שיקולים ניסיוניים מסוימים. ראשית, רוב הפרוטוקולים המפורטים כאן כוללים שימוש בעכברים מהונדסים בעלי חלבוני דיווח פלואורסצנטי במיטוכונדריה או באקסונים של נוירונים מוטוריים. יש לגדל כל אחד מקווי העכבר האלה ולדמותו כהמי-/הטרוזיגוטה. היוצאים מן הכלל, עם זאת, הם קווי העכבר ChAT.Cre ו- Rosa26.tdTomato שניתן לשמור עליהם בנפרד כהומוזיגוטים, כאשר צאצאי ההמיזיגוטים המתקבלים מאפשרים ביטוי tdTomato בתאי עצב כולינרגיים לאחר רקומבינציה של Cre-loxP . כאשר מתרבים בעכברי המי/הטרוזיגוטה מהונדסים מהונדסים (למשל, Mito.CFP) עם עכברי המי-/הטרוזיגוטה מהונדסים אחרים (למשל, ChAT.eGFP), יש לשקול היטב את אסטרטגיית הרבייה, שכן השגת המספרים הרצויים של צאצאים מוטנטיים כפולים יכולה לגזול זמן רב. יתר על כן, כאשר מגדלים את דור ה-F1 של עכברי ChAT.Cre ו-Rosa26.tdTomato (כלומר, ChAT.tdTomato) עם זנים מהונדסים נוספים (למשל, Mito.CFP), יש לצפות לעוד פחות עכברים הנושאים את שלושת הטרנסגנים הרצויים. בנוסף, יש לקחת בחשבון גם את חפיפת הפלואורופור הפוטנציאלית בעת רביית עכברים דו-מדווחים עם תכונות אורך גל סמוכות (למשל, עירור Mito-CFP: 435 ננומטר, פליטה: 485 ננומטר, bred עם עירור ChAT.eGFP: 488 ננומטר, פליטה: 510 ננומטר), אם כי ייתכן שניתן להתגבר על בעיה זו עם אי-ערבוב ספקטרלי58.
טכניקה זו יש כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון. בעבודה זו ובפרוטוקולים הקודמים שלנו 31,32, הראינו כיצד ניתן להשתמש במספר סמנים מקודדים גנטית ובשיטות צביעה שונות כדי לתייג ולעקוב אחר אברונים נפרדים in vivo. עם זאת, לא כל הגשושיות מתאימות לגישה ניסיונית זו. הערכנו זריקות לתוך שריר TA או סולאוס של תת-יחידה של רעלן כולרה בטא (CTB)-488 (0.5-1.5 מיקרוגרם/μL ~ 4 שעות לפני ההדמיה), בדיקה המשמשת באופן שגרתי לתיוג גופי תאי נוירונים מוטוריים בניסויי מעקב in vivo retrograde59,60. עם זאת, כאשר הוזרק לבדו או הוזרק במשותף עם HCT-555, התווית CTB-488 הייתה גרועה למרות השימוש בריכוזים דומים לאלה ששימשו למעקב מוצלח אחר נוירונים מוטוריים בנסיגה. לפיכך, אנו מסיקים שלמרות ש-CTB הוא סמן מצוין במבחנה של איתות אנדוזומים בתרביות נוירונים61, HCT נשאר הגשושית בתקן הזהב לזיהוי אנדוזומים מאותתים in vivo באקסונים עצביים סיאטיים.
באמצעות מסלולים שונים, בדקנו גם בדיקות המשמשות באופן שגרתי לתיוג ליזוזומים, כגון LysoTracker ירוק DND-26, וסמנים של הידרולזות ליזוזומיות פעילות, כגון BODIPY-FL-pepstatin A עבור קתפסין D62 ו- Magic Red עבור קתפסין B, אך ללא הצלחה. ניסינו אספקה תוך שרירית של BODIPY-FL-pepstatin A (2.5 מיקרוגרם לתוך TA ~ 4 שעות לפני ההדמיה), כמו גם הזרקת עצבים תוך-שרירית של 2 μL של LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) או Magic Red (1/10) 30-60 דקות לפני ההדמיה. למרות שהבדיקות הללו הדגישו את העצב, לא הצלחנו למצוא אברונים מסומנים בבירור. הגשושיות הצטברו סביב אקסונים, ככל הנראה נשמרו על ידי תאי שוואן. לפיכך, התיוג הלא מוצלח של ליזוזומים עשוי לנבוע ממתן בדיקה לקויה לתאי עצב, אם כי לא ניתן לשלול את קיומם של ריכוזים מתאימים יותר. בהתחשב בכך שתיוג TMRE פועל בתנאים דומים (כלומר, זריקות עצבים תוך-סיאטיים), עוצמת הסימון עשויה להיות תלוית צבע ויש לבדוק אותה עבור כל סמן באופן עצמאי. עם זאת, אנו מסיקים כי התמקדות בליזוזומים in vivo עם בדיקות אלה אינה אפשרית בריכוזים שצוינו לעיל.
שיטות הרדמה יכולות לשנות קריאות פיזיולוגיות שונות (למשל, תפקוד השבלול63 ואלקטרופיזיולוגיה קליפת המוח64); עם זאת, לא ידוע כיום אם הרדמה משפיעה על הובלה אקסונאלית in vivo בעצב הסיאטי. בהתחשב בפעילות הנוירומוסקולרית המופחתת תחת הרדמה המושרה על ידי איזופלורן, ייתכן כי קינטיקה של תחבורה שונה בהשוואה למצב ההתעוררות. עם זאת, מחקר in vivo היחיד שחקר זאת באופן ישיר גילה כי הובלה של שלפוחיות ליבה צפופות בהקרנות תלמוקורטיות אינה שונה בין עכברים מורדמים לעכברים ערים65. יתר על כן, מכיוון שניתן לזהות הבחנות בהובלה בין עכברים מסוג בר לבין עכברי מודל מחלה תחת הרדמה35,43, ברור שחשיפה לאיזופלורן אינה מונעת זיהוי של הפרעות באיתות על סחר באנדוזומים או במיטוכונדריה.
לפרוטוקול זה יש יישומים פוטנציאליים אחרים, שתוארו להלן. גידול של העכברים המהונדסים המתוארים בפרוטוקול זה (לדוגמה, Mito.CFP, ChAT.eGFP) עם מודלים של עכברים בעלימחלות נוירודגנרטיביות 1,2,3 יאפשר חקירות תת-סוג ו/או מטען ספציפיות לנוירונים. יתר על כן, קווי Cre66 של עכבר שפותחו לאחרונה יאפשרו גם הדמיה של חלבוני כתב פלואורסצנטי באוכלוסיות אקסון חושיות מובחנות. לדוגמה, ניתן לחצות את עכברי Rosa26.tdTomato עם קולטן נוירופפטיד Y -2-מבטא (Npy2r). עכבר Cre כדי לאפשר tdTomato פלואורסצנציה ב nociceptors מיאלינים מסיבי A67. יתר על כן, ניתן להשיג שליטה זמנית גם על ידי שימוש במערכות Cre אינדוקטיביות (למשל, טמוקסיפן)68. יישום פוטנציאלי נוסף מסתמך על זמינותם של עכברים מהונדסים המבטאים חלבוני דיווח פלואורסצנטיים בתאי שוואן. ואכן, עכברי S100-GFP69 ו-PLP-GFP70 מאפשרים הדמיה in vivo ו/או in situ של תאי Schwann והיו בחזית המחקרים המעורבים בנדידת תאי שוואן במהלך התחדשות העצבים ההיקפיים.
בנוסף ליישומים אלה והשלמת עכבר Mito.CFP היא הזמינות של מספר קווי עכבר מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים באברונים שונים, כגון מיטוכונדריה ואוטופגוסומים. לדוגמה, חקירת תובלה מיטוכונדריאלית in vivo עשויה להיות אפשרית עם העכבר mito::mKate271 או עם עכבר mitoDendra הניתן להיפוךפוטו-קונברטיבי 57. יתר על כן, הובלת מיטופאגוזום in vivo עשויה להיות אפשרית באמצעות עכבר mito-Keima רגיש ל-pH72 ועכבר mito-QC73 לניתוחי מיטופגיה. יתר על כן, ניתן להתגבר על קשיי הסימון הליזוזומי שנתקלנו בהם באמצעות שימוש בעכברים המבטאים LAMP1-GFP, עם האזהרה כי LAMP1 קיים גם באברונים אנדוציטיים הנבדלים מליזוזומים74.
לסיכום, סיפקנו דרכים חדשניות להעריך הובלה אקסונלית in vivo של מספר אברונים באקסונים של עצבים היקפיים ספציפיים מעכברים מהונדסים מגוונים. ההדמיה המקבילה של אברונים שונים תהיה חשובה במיוחד, בהתחשב בממצאים האחרונים של אינטראקציות אקסונאליות וסחר משותף של אברונים כגון מיטוכונדריה ואנדוזומים75,76. אנו מאמינים כי השיטות המוצגות יהיו שימושיות לשיפור ההבנה של הפיזיולוגיה הבסיסית של אקסונים in vivo ולהתרת סבך של פתומכניזמים חשובים המניעים ניוון עצבי של עצבים היקפיים.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לרוברט מ. בראונסטון (מכון קווין סקוור לנוירולוגיה, יוניברסיטי קולג ‘בלונדון) על שיתוף ChAT-eGFP, ChAT.Cre ו- Rosa26.tdTomato עכברים, ופייטרו פרטה (מכון קווין סקוור לנוירולוגיה, יוניברסיטי קולג ‘בלונדון) על שיתוף HB9. עכבר GFP. ברצוננו להודות לאלנה ר. ריימס, שרלוט ג’יי.פי קרמרס וקיוהאן לאנג (מכון קווין סקוור לנוירולוגיה, יוניברסיטי קולג ‘בלונדון) על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת ג’וניור לא קלינית מאיגוד מחלות הנוירונים המוטוריים (בריטניה) (Tosolini/Oct20/973-799) (APT), פרסי החוקרים הבכירים של Wellcome Trust (107116/Z/15/Z ו-223022/Z/21/Z) (GS), פרס של קרן המכון הבריטי לחקר דמנציה (GS); ופרס פיתוח קריירה של המועצה למחקר רפואי (MR/S006990/1) (JNS).
Materials
| 0.2 mL PCR tube | |||
| 70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
| AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
| B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
| B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
| Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
| Cotton swab | |||
| Desktop centrifuge | |||
| Dissecting microscope | |||
| Eye lubricant | |||
| Fine curved forceps | Dumont | ||
| Fine straight forceps | Dumont | ||
| Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
| Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
| Hair clippers | |||
| Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
| HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
| Heating pad | |||
| Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
| Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
| Isoflurane | |||
| Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
| Magic tape | invisible tape | ||
| Micropipette puller | |||
| Parafilm | Parafilm | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
| Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
| Saline | |||
| Scalpel blade | Dumont | ||
| Small spring scissors | Dumont | ||
| Surgery/operating microscope | |||
| Surgical drape | |||
| Surgical suture | |||
| Surgical tape | |||
| Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
| Vortex mixer |
Referências
- Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models & Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
- De Giorgio, F., Maduro, C., Fisher, E. M. C., Acevedo-Arozena, A. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037424 (2019).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. The Journal of Cell Biology. 187 (6), 761-772 (2009).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiological Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 482 (2), 123-141 (2005).
- Kaiser, T., Ting, J. T., Monteiro, P., Feng, G. Transgenic labeling of parvalbumin-expressing neurons with tdTomato. Neurociência. 321, 236-245 (2016).
- Zheng, B., Sage, M., Sheppeard, E. A., Jurecic, V., Bradley, A. Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Molecular and Cellular Biology. 20 (2), 648-655 (2000).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Bareyre, F. M., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Sanes, J. R. Transgenic labeling of the corticospinal tract for monitoring axonal responses to spinal cord injury. Nature Medicine. 11 (12), 1355-1360 (2005).
- Willems, J., et al. A CRISPR/Cas9-based genome editing toolbox for epitope tagging of endogenous proteins in neurons. PLoS Biology. 18 (4), 3000665 (2020).
- Huh, Y., Oh, M. S., Leblanc, P., Kim, K. -. S. Gene transfer in the nervous system and implications for transsynaptic neuronal tracing. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (5), 763-772 (2010).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: an approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Scientific Reports. 6, 33058 (2016).
- Andrews, M. R. Gene therapy in the CNS-one size does not fit all. Gene Therapy. 28 (7-8), 393-395 (2021).
- Kügler, S. Tissue-specific promoters in the CNS. Methods in Molecular Biology. 1382, 81-91 (2016).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), 108697 (2014).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Maday, S., Twelvetrees, A. E., Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. F. Axonal transport: cargo-specific mechanisms of motility and regulation. Neuron. 84 (2), 292-309 (2014).
- Terenzio, M., Schiavo, G., Fainzilber, M. Compartmentalized signaling in neurons: from cell biology to neuroscience. Neuron. 96 (3), 667-679 (2017).
- Abouward, R., Schiavo, G. Walking the line: mechanisms underlying directional mRNA transport and localisation in neurons and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2665-2681 (2021).
- Sleigh, J. N., Rossor, A. M., Fellows, A. D., Tosolini, A. P., Schiavo, G. Axonal transport and neurological disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 691-703 (2019).
- Bronfman, F. C., Moya-Alvarado, G. BDNF/TrkB signaling endosomes mediate long-distance dendritic growth by activating CREB/PI3K-mTOR-dependent translation in neuronal cell bodies. BioRxiv. , (2020).
- Nagano, S., Araki, T. Axonal Transport and Local Translation of mRNA in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 697973 (2021).
- Boecker, C. A., Olenick, M. A., Gallagher, E. R., Ward, M. E., Holzbaur, E. L. F. ToolBox: Live Imaging of intracellular organelle transport in induced pluripotent stem cell-derived neurons. Traffic. 21 (1), 138-155 (2020).
- Surana, S., et al. The evolution of the axonal transport toolkit. Traffic. 21 (1), 13-33 (2020).
- Sleigh, J. N., Vagnoni, A., Twelvetrees, A. E., Schiavo, G. Methodological advances in imaging intravital axonal transport. F1000Research. 6, 200 (2017).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Sleigh, J. N., Tosolini, A. P., Schiavo, G. In vivo imaging of anterograde and retrograde axonal transport in rodent peripheral nerves. Methods in Molecular Biology. 2143, 271-292 (2020).
- Gibbs, K. L., et al. Inhibiting p38 MAPK alpha rescues axonal retrograde transport defects in a mouse model of ALS. Cell Death & Disease. 9 (6), 596 (2018).
- Fellows, A. D., Rhymes, E. R., Gibbs, K. L., Greensmith, L., Schiavo, G. IGF1R regulates retrograde axonal transport of signalling endosomes in motor neurons. EMBO Reports. 21 (3), 49129 (2020).
- Bilsland, L. G., Sahai, E., Kelly, G., Golding, M., Greensmith, L., Schiavo, G. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (47), 20523-20528 (2010).
- Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. The Journal of Cell Biology. 218 (6), 1871-1890 (2019).
- Bercsenyi, K., et al. Tetanus toxin entry. Nidogens are therapeutic targets for the prevention of tetanus. Science. 346 (6213), 1118-1123 (2014).
- Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293-305 (2006).
- Debaisieux, S., Encheva, V., Chakravarty, P., Snijders, A. P., Schiavo, G. Analysis of signaling endosome composition and dynamics using SILAC in embryonic stem cell-derived neurons. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 542-557 (2016).
- Surana, S., et al. The travel diaries of tetanus and botulinum neurotoxins. Toxicon. 147, 58-67 (2018).
- Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Lazo, O. M. The many disguises of the signalling endosome. FEBS Letters. 592 (21), 3615-3632 (2018).
- Malik, B., et al. Absence of disturbed axonal transport in spinal and bulbar muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 20 (9), 1776-1786 (2011).
- Sleigh, J. N., et al. Mice carrying ALS mutant TDP-43, but not mutant FUS, display in vivo defects in axonal transport of signaling endosomes. Cell Reports. 30 (11), 3655-3662 (2020).
- Tosolini, A. P., Sleigh, J. N., Surana, S., Rhymes, E. R., Cahalan, S. D., Schiavo, G. modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. BioRxiv. , (2021).
- Restani, L., et al. Botulinum neurotoxins A and E undergo retrograde axonal transport in primary motor neurons. PLoS Pathogens. 8 (12), 1003087 (2012).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52846 (2015).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Frontiers in Neurology. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neurociência. 274, 318-330 (2014).
- Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60993 (2020).
- Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61264 (2020).
- Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. -. J. Analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60548 (2020).
- Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), e62959 (2021).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Bohnert, S., Schiavo, G. Tetanus toxin is transported in a novel neuronal compartment characterized by a specialized pH regulation. The Journal of Biological Chemistry. 280 (51), 42336-42344 (2005).
- Kanai, A., et al. Low-concentration lidocaine rapidly inhibits axonal transport in cultured mouse dorsal root ganglion neurons. Anesthesiology. 95 (3), 675-680 (2001).
- Bolea, I., Gan, W. -. B., Manfedi, G., Magrané, J. Imaging of mitochondrial dynamics in motor and sensory axons of living mice. Methods in Enzymology. , 97-110 (2014).
- Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Multispectral live-cell imaging. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 46 (2018).
- Blum, J. A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons. Nature Neuroscience. 24 (4), 572-583 (2021).
- Xu, J., et al. An approach to maximize retrograde transport based on the spatial distribution of motor endplates in mouse hindlimb muscles. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 707982 (2021).
- Wang, T., et al. Flux of signalling endosomes undergoing axonal retrograde transport is encoded by presynaptic activity and TrkB. Nature Communications. 7, 12976 (2016).
- Chen, C. S., Chen, W. N., Zhou, M., Arttamangkul, S., Haugland, R. P. Probing the cathepsin D using a BODIPY FL-pepstatin A: applications in fluorescence polarization and microscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 42 (3), 137-151 (2000).
- Cederholm, J. M. E., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hearing Research. 292 (1-2), 71-79 (2012).
- Michelson, N. J., Kozai, T. D. Y. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
- Knabbe, J., Nassal, J. P., Verhage, M., Kuner, T. Secretory vesicle trafficking in awake and anaesthetized mice: differential speeds in axons versus synapses. The Journal of Physiology. 596 (16), 3759-3773 (2018).
- Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
- Arcourt, A., et al. Touch receptor-derived sensory information alleviates acute pain signaling and fine-tunes nociceptive reflex coordination. Neuron. 93 (1), 179-193 (2017).
- Valny, M., Honsa, P., Kirdajova, D., Kamenik, Z., Anderova, M. Tamoxifen in the mouse brain: implications for fate-mapping studies using the tamoxifen-inducible Cre-loxP system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 243 (2016).
- Hayashi, A., et al. A double-transgenic mouse used to track migrating Schwann cells and regenerating axons following engraftment of injured nerves. Experimental Neurology. 207 (1), 128-138 (2007).
- Chen, B., Chen, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. -. P. Analysis of schwann cell migration and axon regeneration following nerve injury in the sciatic nerve bridge. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 308 (2019).
- Barrasso, A. P., Tong, X., Poché, R. A. The mito::mKate2 mouse: A far-red fluorescent reporter mouse line for tracking mitochondrial dynamics in vivo. Genesis. 56 (2), (2018).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. The Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Cheng, X. -. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. The Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Cioni, J. -. M., Lin, J. Q., et al. Late Endosomes Act as mRNA Translation Platforms and Sustain Mitochondria in Axons. Cell. 176 (12), 56 (2019).
- Liao, Y. -. C., Fernandopulle, M. S., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179 (1), (2019).
