JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

توسيع مجموعة أدوات التصوير في الجسم الحي للنقل المحوري

Published: December 23, 2021
doi:
10.3791/63471
, , ,
1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology,University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre,University College London, 3UK Dementia Research Institute,University College London

Summary

باستخدام الفئران الفلورية المعدلة وراثيا ، يتم وصف بروتوكولات مفصلة لتقييم النقل المحوري في الجسم الحي للإشارات الداخلية والميتوكوندريا داخل المحاور الحركية والحسية للعصب الوركي السليم في الحيوانات الحية.

Abstract

يحافظ النقل المحوري على التوازن العصبي من خلال تمكين الاتجار ثنائي الاتجاه للعضيات والشحنات المتنوعة. الاضطرابات في النقل المحوري لها عواقب وخيمة على الخلايا العصبية الفردية وشبكاتها ، وتسهم في عدد كبير من الاضطرابات العصبية. نظرا لأن العديد من هذه الحالات تنطوي على آليات مستقلة وغير مستقلة للخلايا ، وغالبا ما تعرض مجموعة من الأمراض عبر الأنواع الفرعية العصبية ، فإن طرق تحديد وتحليل المجموعات الفرعية العصبية بدقة أمر حتمي.

تفصل هذه الورقة بروتوكولات لتقييم الانتقال المحوري في الجسم الحي للإندوسومات والميتوكوندريا في الأعصاب الوركية للفئران المخدرة. يتم توفير تعليمات تدريجية ل 1) التمييز بين الخلايا العصبية الحركية والحسية في الجسم الحي ، في الموقع ، وخارج الجسم الحي باستخدام الفئران التي تعبر بشكل انتقائي عن البروتينات الفلورية داخل الخلايا العصبية الحركية الكولينية ؛ و 2) تقييم منفصل أو متزامن في الجسم الحي النقل المحوري للإشارات endosomes والميتوكوندريا. تسهل هذه الأساليب التكميلية داخل الحيوية التصوير المتزامن للشحنات المختلفة في محاور عصبية محيطية متميزة لمراقبة النقل المحوري كميا في الصحة والمرض.

Introduction

يربط الجهاز العصبي المحيطي (PNS) الجهاز العصبي المركزي (CNS) بأهدافه البعيدة ، مما يسمح بترحيل الإشارات المؤثرة لممارسة التحكم الحركي والإشارات القريبة لتوفير التغذية المرتدة الحسية. باستخدام العديد من التطورات في علم الوراثة الفئران ، طور العلماء نماذج مختلفة للفئران للتحقيق في العديد من الأمراض / المتلازمات التي تصيب PNS1،2،3. نظرا لأن معظم الأمراض العصبية التنكسية متعددة العوامل مع مساهمات مستقلة وغير مستقلةللخلايا 4,5 ، فإن فك تشابك الأمراض الخاصة بالخلايا / الخلايا العصبية يمكن أن يوفر رؤى حاسمة وجديدة في آليات المرض.

تحقيقا لهذه الغاية ، مكن تطوير الفئران المعدلة وراثيا من الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC)6 من التعبير الذاتي الانتقائي عن البروتينات الفلورية في مجموعات فرعية مستهدفة من الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، تتوفر الفئران المعدلة وراثيا BAC ، والتي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) في الخلايا العصبية الكولينية7 أو الخلايا العصبية السكرية8 ، أو بروتين الفلورسنت الأحمر المتغير (tdTomato) في الخلايا العصبية إيجابية البارفالبومين9. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق التعبير العصبي الانتقائي للبروتينات الفلورية عبر تقنية Cre-loxP 10. على سبيل المثال ، يمكن تربية سلالات الفئران التي تعبر عن Cre-recombinase في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، الكولين أستيل ترانسفيراز (ChAT)-Cre) مع الفئران التي تعبر عن بروتين الفلورسنت (على سبيل المثال ، tdTomato أو GFP) من موضع تأسيسي (على سبيل المثال ، Gt (ROSA) 26Sor) تحت سيطرة مثبط النسخ المحاط بمواقع loxP11 (على سبيل المثال ، توليد الفئران التي تعبر عن tdTomato فقط في الخلايا العصبية الكولينية). في الواقع ، باستخدام إعادة تركيب Cre-loxP ، تم إنشاء الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأصفر في محاور الجهاز القشري الشوكي الهابط12.

بالإضافة إلى ذلك، فإن التطورات الحديثة في تحرير الجينات CRISPR/Cas9، مثل ORANGE، تمكن من وضع علامات الفلورسنت على العديد من البروتينات العصبية الذاتية، مع التعبير الذي يمكن تحقيقه بدقةنانوية 13. علاوة على ذلك ، بالاقتران مع سلالات الفئران المعبرة عن Cre ، يمكن استخدام ORANGE-CAKE لوضع علامة على العديد من البروتينات الداخلية في الخلايا العصبية الفردية13. بدلا من ذلك ، يسمح تتبع الخلايا العصبية بوساطة فيروسية أيضا بوضع علامات على المجموعات الفرعية العصبية ويمكن تحقيقه من خلال مجموعات مستهدفة من الأنماط المصلية الفيروسية و / أو المروجين الخاصين بالخلايا14،15،16،17.

بالإضافة إلى طرق وضع العلامات العصبية، تم تصميم خطوط الفئران أيضا للتعبير عن بروتينات المراسل التي تستهدف عضيات معينة، مثل الميتوكوندريا التي تعبر عن بروتين الفلورسنت السماوي (Mito.CFP)18 أو البلعمة الذاتية التي تعبر عن GFP (LC3.GFP)19. علاوة على ذلك ، تم تصميم خطوط الماوس لتقييم ديناميكيات الكالسيوم على وجه التحديد في الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، Thy1.GCaMP)20،21. وإجمالا، ومع تقدم مثل هذه النماذج، تمكن التطبيقات التجريبية الجديدة العلماء من طرح أسئلة بيولوجية ومرضية أكثر دقة حول الجهاز العصبي المركزي و PNS.

الدور الرئيسي للأعصاب الحركية الطرفية هو نقل الإشارات الكهربائية إلى العضلات الهيكلية لإثارة الحركة. بالإضافة إلى ذلك ، وتحدث على مدى نطاقات زمنية أطول ، فإن الرسائل العصبية الكيميائية والفسيولوجية في شكل عضيات متنوعة (على سبيل المثال ، الميتوكوندريا ، الإندوليزوسومات ، الإندوسومات الإشارية) تجتاز الشبكة الخلوية الهيكلية بطريقة أحادية أو ثنائية الاتجاه للمساعدة في الحفاظ على التوازن العصبي22،23،24. ضعف في النقل المحوري له عواقب وخيمة على صحة الخلايا العصبية ويرتبط بالعديد من أمراض النمو العصبي والتنكس العصبي25. على المستوى الجزيئي ، يمكن أن تؤدي الإعاقات في النقل المحوري إلى تعطيل الأحداث الفسيولوجية التي تنظم الإشارات المشبكية واللدونة ، والنسخ الجيني ، والترجمة المحلية في جميع أنحاء المحور العصبي26,27. في حين أن هناك العديد من الأدوات لدراسة هذه الأحداث في الخلايا / الخلايا العصبية المستزرعة28,29 ، فإن تقييم ديناميكيات النقل المحورية والأحداث البيولوجية المرتبطة بالمحور في الجسم الحي مطلوب لتأكيد الأفكار الرئيسية في العمليات الفسيولوجية والمرضية30.

على مر السنين ، قام مختبر Schiavo بتحسين البروتوكولات لطرح أسئلة متنوعة حول النقل المحوري31،32،33،34،35،36. توسعت هذه التجارب من اكتشاف أن جزءا غير سام من السم الكزاز (HCT) المسمى بالفلورسنت يتم استيعابه في أطراف محورية في العضلات الهيكلية من خلال التفاعلات مع nidogens و polysialogangliosides37. بمجرد استيعابه ، يتم نقل HCT بأثر رجعي في Rab7 إيجابي ، يحتوي على إشارات عصبية موجهة إلى الأجسام الخلوية للخلايا العصبية والخلايا العصبية38،39،40،41. وبالتوازي مع ذلك، مكن التقدم في تكنولوجيا التصوير من التحليل في الوقت الحقيقي لحزم الأعصاب الطرفية والمحاور الفردية في الفئران الحية المخدرة30. كشفت الغزوة الأولى في تقييم ديناميكيات النقل المحوري في الجسم الحي في علم الأمراض عن ضعف مسبق الأعراض في نقل الإندوسومات والميتوكوندريا في نموذج الفأر SOD1G93A للتصلب الجانبي الضموري (ALS)35. الأهم من ذلك ، من غير المرجح أن تمثل هذه العيوب ببساطة عواقب ثانوية للتنكس العصبي ، بالنظر إلى اكتشاف أن فقدان الخلايا العصبية الحركية يمكن أن يحدث في غياب اضطرابات النقل المحورية في نموذج الفأر لمرض كينيدي42 ونموذج FUS المتحور غير المتجانس الزيجوت من ALS43. يمكن علاج هذا العجز في النقل المحوري في فئران ALS باستخدام مثبطات كينازات محددة33 أو مستقبلات عامل النمو34. علاوة على ذلك ، فإن علاج الخلايا العصبية باستخدام حاصرات ديسيتيلاز هيستون محددة يغير نقل الميتوكوندريا في الجسم الحي36. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا أن التعديل المعتمد على BDNF للنقل المحوري غير منظم في أنواع فرعية متميزة من الخلايا العصبية الحركية في فئران ALS44.

باستخدام مجموعة أدوات دائمة التوسع لتقييم ديناميكيات النقل المحوري28,29 ، يحدد بروتوكول الفيديو هذا العديد من التطبيقات التي ستسمح بمزيد من الرؤى حول السيناريوهات البيولوجية والمرضية المختلفة. أولا ، تستخدم الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر بشكل انتقائي عن البروتينات الفلورية في الخلايا العصبية الكولينية (أي الخلايا العصبية الحركية) للتمييز بين المحاور الحركية والحسية في كل من الجسم الحي والجسم الحي السابق. ثم يتم تحميل HCT المسمى بالفلورسنت في إندوسومات الإشارة في ثلاثة خطوط معدلة وراثيا للتمييز بين ديناميكيات النقل المحورية في الخلايا العصبية الطرفية المتميزة. يفصل البروتوكول التجريبي التالي نهج التألق متعدد الإرسال لتقييم انتقال الميتوكوندريا على وجه التحديد في الخلايا العصبية الحركية عن طريق تربية الفئران ChAT.tdTomato مع فئران Mito-CFP. وأخيرا، يتم توفير تعليمات حول كيفية تصوير الميتوكوندريا في وقت واحد وإشارات الإندوسومات داخل نفس المحور العصبي في الجسم الحي.

Protocol

تم إجراء جميع عمليات التعامل مع الفئران والتجارب وفقا لقانون الحيوانات (الإجراءات العلمية) (1986) وتمت الموافقة عليها من قبل كلية لندن الجامعية – لجنة أخلاقيات معهد كوين سكوير لطب الأعصاب. 1. الحيوانات إيواء جميع الحيوانات في أقفاص ذات تهوية فردية في بيئة يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة والرطوبة والحفاظ عليها في دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء. استخدام كل من الفئران الذكور والإناث من السلالات المعدلة وراثيا التالية: 1) الفئران Tg (Chat-EGFP) غير المتجانسة الزيجوت GH293Gsat/Mmucd ، المشار إليها باسم الفئران ChAT.eGFP ؛ 2) B6.Cg-Tg (Hlxb9-GFP) 1Tmj / J ، يشار إليها باسم HB9. الفئران GFP. و 3) B6.Cg-Tg غير متجانسة الزيجوت (Thy1-CFP / COX8A) S2Lich / J ، يشار إليها باسم الفئران Mito.CFP. توليد الفئران ChAT.tdTomato عن طريق عبور B6 متماثل الزيجوت B6 ؛ 129S6-Chat tm2 (cre) Lowl / J ، المشار إليه باسم الفئران ChAT.Cre ، مع B6.Cg-GT (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze / J ، المشار إليها باسم الفئران Rosa26.tdTomato. توليد الفئران ChAT.tdTomato::Mito.CFP عن طريق عبور الفئران غير المتجانسة ChAT.tdTomato مع الفئران Mito.CFP غير المتجانسة. 2. الحقن العضلي من الفلورسنت HCT التحضير قبل الجراحة تم دمج Express H C T (HCT441 ، المخلفات 875-1315) في علامة محسنة غنية بالسيستين في البكتيريا كبروتين اندماج الجلوتاثيون – S – transferase وفقا ل 45. قم بتسمية H C T مع AlexaFlour555C2 maleimide31 ، وقم بتسخينه في مخزن مؤقت لغسيل الكلى على الجليد البارد (10 mM HEPES-NaOH ، 100 mM NaCl ، الرقم الهيدروجيني 7.4) ، وقم بتجميده في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية. قبل إجراء التجارب في الجسم الحي ، قم أولا باختبار HCT في المختبر لنجاح الامتصاص والنقل في الخلايا العصبية الأولية. تمييع الفلورسنت HC T (على سبيل المثال ، HCT-555) إلى تركيز نهائي ومتسق تجريبيا يتراوح من 2.5 إلى 10 ميكروغرام / ميكرولتر في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) في أنبوب 0.2 مل. في هذه الخطوة ، أضف المزيد من المركبات / العوامل إلى محلول HCT إذا لزم الأمر (على سبيل المثال ، عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ).ملاحظة: يجب أن يكون الحجم النهائي مناسبا لحجم العضلات (العضلات) محل الاهتمام. على سبيل المثال ، قم بإعداد حجم حقن من 3-4 ميكرولتر للعضلة الأمامية (TA) و ~ 1 ميكرولتر للعضلة الوحيدة الأصغر. حافظ على تركيز عمل HCT بين 2.5 و 10 ميكروغرام / ميكرولتر بغض النظر عن الحجم النهائي. امزج محلول HCT باستخدام ماصة أو دوامة ، وقم بالدوران لفترة وجيزة بسرعة منخفضة باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي لجمع السائل وإزالة الفقاعات الكبيرة. حماية HCT من الضوء والنقل على الجليد. استخدم ماصة زجاجية صغيرة مسحوبة للحقن العضلي الأمثل في العضلات الأصغر (على سبيل المثال ، النعل) أو لحقن العصب داخل الورك. اسحب الماصات الدقيقة الزجاجية المتدرجة (وفقا ل 46) قبل الجراحة.ملاحظة: لتمكين السحب وتقييد التدفق لأعلى وخارج الجزء الخلفي من الماصة المجهرية ، قم بفصل قطعة صغيرة بعناية من الطرف الحاد باستخدام ملقط دقيق تحت مجهر تشريح. احرص على التخلص من الطرف المكسور في الصندوق المناسب. تعقيم وتنظيف جميع الأدوات الجراحية قبل الاستخدام. الجراحة – الحقن العضلي استعد للجراحة عن طريق تأمين ستارة جراحية معقمة على حصيرة حرارية مضبوطة على 37 درجة مئوية. وضع وتركيز المجهر التشغيلي. لبدء الجراحة ، قم بتفريغ الأدوات الجراحية المعقمة مسبقا ، والشريط الجراحي ، ومسحات القطن المعقمة ، والإيثانول 70٪ (v / v) في الماء ، والمحلول الملحي المعقم ، والغرز ، وإبرة هاميلتون أو الماصات الزجاجية المسحوبة. تأكد من أن آلة التخدير تحتوي على ما يكفي من الأكسجين والأيزوفلوران طوال مدة العملية الجراحية. توجيه تدفق التخدير إلى غرفة الحث وتشغيل آلة التخدير. للبدء ، استخدم معدل تدفق الأكسجين من 1-2 لتر / دقيقة و 5٪ isoflurane. ضع الماوس في غرفة الحث لبدء التخدير. عندما يكون منعكس التصحيح غائبا ، قلل التخدير إلى 2-3٪ isoflurane ، ووجه تدفق التخدير إلى لسان حال ، وانقل الماوس إلى لسان حال الموجود في منطقة منفصلة من المساحة الجراحية. تأكد من غياب كل من ردود فعل انسحاب القرنية والدواسة قبل حلاقة منطقة الفراء التي تغطي العضلات (العضلات) المراد حقنها. عند الانتهاء، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الفراء الحليق من الماوس باستخدام الجانب اللزج من الشريط الجراحي، وضع الماوس على موازين الوزن لتسجيل وزنه قبل الجراحة. ضع مواد تشحيم العين بعناية باستخدام قطعة قطن وانقل الماوس ولسان الحال إلى المنطقة الجراحية.ملاحظة: حاول الحد من كمية الفراء الحليق التي يتم نقلها أيضا إلى المنطقة الجراحية. استخدم شريطا جراحيا لتثبيت الرأس على لسان الحال لمنع الماوس من الانزلاق. باستخدام قطعة قطن منفصلة ، ضع الإيثانول على المنطقة المحلوقة لتعقيم وتقليل تلوث الفراء. ضع الجسم وفقا للعضلة المراد حقنها. على سبيل المثال ، بالنسبة ل TA ، ضع الماوس على ظهره وقم بتمديد الطرف الخلفي عند ~ 10 درجات من خط الوسط. بدلا من ذلك ، بالنسبة للحقن المنفرد ، ضع الحيوان على جانبه وقم بتمديد الطرف الخلفي عند ~ 45 درجة من خط الوسط. عندما يكون الطرف الخلفي في الموضع الصحيح ، استخدم الشريط الجراحي عبر القدم لمنع الحركة غير المرغوب فيها أثناء الجراحة.ملاحظة: تم تفصيل إجراءات الحقن لعضلات TA و gastrocnemius و solus سابقا32. قبل إجراء شق ، تأكد من أن التخدير كاف عن طريق اختبار منعكس سحب الدواسة. مراقبة التخدير باستمرار والحفاظ عليه طوال العملية الجراحية مع تقييم منتظم للتنفس ومنعكس الانسحاب. عند هذه النقطة ، ارسم محلول HCT العامل في حقنة هاميلتون أو الماصة الدقيقة الزجاجية المسحوبة. قم بعمل شق صغير فوق العضلات (العضلات) ذات الأهمية في المنطقة (المناطق) التي تتوافق مع مناطق لوحة نهاية المحرك46,47,48. اخترق اللفافة الخارجية على العضلات وحقن HCT ببطء وفقا ل 32. اترك المحقنة / الماصة الدقيقة في موضعها لمدة 5-10 ثوان قبل الانسحاب ببطء. أغلق الشقوق ب 1-2 خيوط وانقل الماوس إلى قفص استرداد معزول. راقب الفأر بعد الجراحة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، قبل إعادته إلى القفص المنزلي. عندما يتعافى الفأر بنجاح وتكتمل المراقبة بعد الجراحة ، أعد القفص إلى ظروف السكن العادية. 3. في الجسم الحي النقل المحوري كشف العصب الوركي اضبط الغرفة البيئية للمجهر على 37 درجة مئوية قبل 1 ساعة على الأقل من التصوير. استعد لفضح العصب الوركي عن طريق ترتيب الستارة الجراحية والأدوات والشريط ومسحات القطن المعقمة والإيثانول بنسبة 70٪ والمحلول الملحي المعقم حول المنطقة الجراحية. تأكد من أن آلة التخدير تحتوي على مخازن كافية من الأكسجين والأيزوفلوران لمدة تصل إلى 2 ساعة لكل ماوس. قم بإنشاء إسفين من البارافيلم أو الشريط غير المرئي عن طريق قطعه إلى مستطيل ضيق (على سبيل المثال ، عرض ~ 1 سم للفئران الكبيرة) بطرف زاوية ووضعه تحت العصب الوركي المكشوف للمساعدة في عملية التصوير. ضع غرفة الحث فوق حصيرة حرارية واضبطها على درجة حرارة الجسم.ملاحظة: أربع ساعات هي الوقت الكافي لأخذ HCT ونقله بأثر رجعي من موقع الحقن إلى العصب الوركي. وبالتالي ، يمكن إعداد فأر واحد لإعادة التخدير بعد هذا الوقت. قم بتوجيه تدفق التخدير إلى غرفة الحث ، وقم بتشغيل آلة التخدير بمعدل تدفق أكسجين يبلغ 1-2 لتر / دقيقة و 3-4٪ isoflurane ، وضع الماوس في غرفة الحث لبدء التخدير.ملاحظة: نظرا لأن تجربة النقل المحوري في الجسم الحي هي إجراء طرفي ، فليست هناك حاجة لتليين العينين. عندما يكون منعكس التصحيح غائبا ، قلل التخدير إلى 2-3٪ isoflurane ، ووجه تدفق التخدير إلى لسان الحال ، وانقل الماوس إلى لسان الحال. استخدم الشريط الجراحي لتثبيت الرأس على لسان الحال، وتمديد الطرف الخلفي المستهدف عند ~ 45 درجة من خط الوسط، واستخدام الشريط الجراحي فوق القدم للحفاظ على هذا الوضع.ملاحظة: يعد التخدير المنخفض مفيدا في هذه المرحلة لأنه يمكن أن يحد من تأثير تنفس القطع الأثرية أثناء عملية التصوير. تأكد من غياب ردود فعل انسحاب القرنية والدواسة ، ثم استخدم المقص لقطع الجلد الذي يغطي العصب الوركي32 (أي مساحة كبيرة تمتد من الحبل الشوكي المركزي إلى منتصف الطرف الخلفي السفلي). قم بإزالة عضلة الفخذ ذات الرأسين العلوية ، وكذلك أي عضلات أخرى ونسيج ضام بالقرب من العصب الوركي. تجنب إتلاف العصب الوركي والأوعية الدموية المحيطة به، وخاصة تلك الموجودة بالقرب من الجانب الجانبي للرضفة / الجانب القريب من رأس المعدة الجانبية. عندما يتعرض العصب الوركي السليم بما فيه الكفاية ، ضع محلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا على المنطقة المحيطة بالعصب الوركي لمنع الجفاف. استخدم ملقط منحني لتعطيل النسيج الضام العميق ووضع “إسفين” البارافيلم المعد مسبقا تحت العصب. عند الانتهاء، ضع الصوف القطني المنقوع بمحلول ملحي على المنطقة المكشوفة وحرك الماوس في غرفة الحث الموضوعة أعلى الحصيرة الحرارية (مضبوطة على 37 درجة مئوية)، والتي يجب أن تظل مملوءة بالأيزوفلوران في O2. In vivo التصوير المحوريضع غطاء زجاجي مقاس 22 × 64 مم على مرحلة المجهر المخصصة وقم بتأمين موقعه بالشريط. حدد وطبق زيت الغمر على الهدف ، ثم قم بتوصيل مرحلة المجهر بالمجهر المقلوب. ارفع الهدف المغمور بالزيت ببطء حتى يتم الاتصال بين الزيت وغطاء الزجاج.ملاحظة: يمكن استخدام أهداف الغمر بالزيت DIC Plan-Apochromat ذات الفتحة العددية 40x و 1.3 (NA) أو أهداف غمر الزيت DIC Plan-Apochromat 63x و 1.4 NA DIC Plan-Apochromat لتصوير النقل في الجسم الحي في العصب الوركي. حرك لسان حال التخدير إلى مرحلة المجهر وقم بتأمين خراطيم التخدير بشريط لمنع اضطراب التخدير. قم بإزالة الصوف القطني من العصب الوركي ونقل الماوس من غرفة الحث إلى لسان الحال ، مع العصب المكشوف الذي يواجه غطاء الزجاج. استخدم الشريط الجراحي لضمان تثبيت رأس الماوس على لسان الحال والحفاظ على أدنى مستوى فعال من التخدير. ارفع الماوس برفق من ذيله وأضف محلول ملحي معقم إلى الغطاء بالقرب من العصب الوركي المكشوف للحد من الجفاف والمساعدة في التصوير.ملاحظة: أغلق جميع أبواب الغرفة البيئية لضمان بقاء المنطقة في درجة حرارة الجسم. باستخدام المناظير ، حدد موقع العصب الوركي ، وحدد النقطة البؤرية المثلى ، وحدد منطقة الاهتمام التي تحتوي على عضيات محورية متحركة.ملاحظة: سبق وصف شرح مفصل لهذه العملية32. قم بالتبديل إلى برنامج الكمبيوتر بالنقر فوق الزر اكتساب (أو ما يعادله)، وحدد مجال اهتمام. استخدم تكبير/تصغير رقمي للحصول على ما مجموعه >80x تكبير وتدوير المنطقة المحددة لتصور المحاور أفقيا (على سبيل المثال، البضائع المتحركة من اليمين إلى اليسار والبضائع المتحركة من اليسار إلى اليمين).ملاحظة: تعتمد معلمات الاتجاه على المستخدم، ولكن يجب أن تظل متسقة طوال التجارب. قم بتحسين كثافة الإشارة عن طريق ضبط المعلمات مثل شدة الليزر (0.2 – 1٪) ، وفتحة الثقب (1 AU – الحد الأقصى) ، والكسب (Master) (700 – 1000) ، والإزاحة الرقمية (-50 – 0) ، والكسب الرقمي (1.0 – 4.0). للحد من التأثير المحتمل للسمية الضوئية ، حافظ على كثافة الليزر عند ≤ 1٪ حيثما أمكن ذلك ، مع أقصى كثافة ليزر تبلغ 2٪. قم بتغيير جميع المعلمات الأخرى قبل ضبط شدة الليزر للكشف الأمثل عن الإشارة. انقر فوق مربع المناطق (أو ما يعادلها)، وحدد منطقة مستطيلة الاهتمام، ثم في وضع الاكتساب (أو ما يعادلها)، واضبط حجم الإطار على 1024 × 1024 بكسل كحد أدنى، وابدأ في الحصول على 100-1000 إطار بفاصل زمني.ملاحظة: يعتمد معدل الحصول على الإطار المطلوب على المستخدم (على سبيل المثال، يمكن تقييم النقل بمعدلات إطارات تتراوح بين 0.1 و6 ثوان) ويمكن تعديله باستخدام معلمات البرامج، مثل منطقة الاهتمام، ووقت سرعة المسح، ومتوسط الاستحواذ، واتجاه الليزر. على سبيل المثال، للحصول على معدل إطارات أبطأ، قم بزيادة ارتفاع/عرض المنطقة محل الاهتمام، والحصول على سرعات مسح ضوئي أبطأ، وزيادة متوسط الاقتناء، واستخدام اتجاه ليزر واحد، والعكس صحيح للحصول على معدل إطارات أسرع. يجب أن يظل معدل الحصول على الإطار متسقا عبر مجموعات البيانات القابلة للمقارنة لأن التصوير بترددات مختلفة قد يسبب تناقضات. تتطلب الشحنات السريعة مثل إشارات الإندوسومات معدل إطارات أسرع (على سبيل المثال 0.1-3 ثانية) مقارنة بالعضيات الأبطأ مثل الميتوكوندريا التي يمكن تحليلها باستخدام معدل أبطأ (على سبيل المثال 2.5-6 ثانية). اهدف إلى التقاط ما لا يقل عن 10 شحنات متحركة من ثلاثة محاور محورية على الأقل لكل ماوس.ملاحظة: استنادا إلى حسابات القدرة ثنائية العينة وذات الوجهين (مع قدرة قياسية تبلغ 0.8 (1-β) ومعدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5٪ (α))، فإن أحجام العينات من 6-8 كافية لتحديد اختلافات النقل المحورية بين نماذج النوع البري ونماذج الأمراض35,43. بمجرد اكتمال التصوير ، قم بالقتل الرحيم للفأر على الفور أثناء وجوده تحت التخدير (على سبيل المثال ، خلع عنق الرحم). يمكن أيضا حصاد أنسجة ما بعد الوفاة ، مثل العضلات والأعصاب الوركية ، لمزيد من التحليل.

Representative Results

تفصل هذه الورقة بروتوكولا متعدد الاستخدامات يوسع مجموعة أدوات النقل المحوري في الجسم الحي في نماذج القوارض. يوضح الشكل 1 أنه يمكن تمييز محاور الخلايا العصبية الحركية عن كل من محاور الخلايا العصبية الحسية وخلايا شوان باستخدام الفئران المعدلة وراثيا. يصور الشكل 1A تعبير eGFP في محاور المحرك الكوليني من ماوس ChAT.eGFP الحي المخدر. يستخدم الشكل 1B طريقة بديلة لتحقيق تعبير tdTomato في عصب تم استئصاله حديثا (أي عدم معالجة الأنسجة الإضافية) من فأر ChAT.tdTomato. وبالتالي ، فإن استخدام السلالات المعدلة وراثيا مثل ChAT.eGFP أو ChAT.tdTomato أو Hb9.GFP يمكن من وضع العلامات الخاصة بمحور المحرك في الجسم الحي. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تحديد المحاور العصبية عن طريق حقن المقتفيات / العلامات (على سبيل المثال ، HCT 31,32 أو الفيروسات التي تشفر eGFP15) في العضلات الهيكلية. يسلط الشكل 2 الضوء على مثل هذا التطبيق ، حيث يصور ثمانية محاور إيجابية ChAT.eGFP تعبر بقوة تحتوي على إشارات إيجابية HCT-555 (الأسهم البيضاء) ، ~ 4 ساعات بعد حقن المسبار في عضلة TA. باستخدام هذا التصميم التجريبي ، يمكننا تحديد الخلايا العصبية α الحركية التي تعصب TA ، والتي هي في الغالبسريعة التعب 44. وكانت خمسة محاور أخرى من محاور ChAT.eGFP ذات تعبير eGFP أقل قوة (الشكل 2A، العلامات النجمية البرتقالية) خارج التركيز جزئيا ومن المرجح أن تكون أعمق قليلا داخل العصب الوركي. علاوة على ذلك ، حددنا الإندوسومات ذات الإشارات الإيجابية HCT-555 في المحاور الحسية السالبة eGFP (الأسهم الصفراء). على هذا النحو ، باستخدام هذا النموذج التجريبي ، يمكن للمرء أن يقيم ويقارن على وجه التحديد النقل المحوري للإندوسومات ذات الإشارات في الخلايا العصبية الحركية مقابل الحسية في الجسم الحي. في الواقع ، باستخدام سلالة المراسل المعدلة وراثيا هذه ، اكتشفنا أن نقل الإندوسومات ذات الإشارات في محاور المحرك الإيجابية ChAT.eGFP أسرع من المحاور الحسية السالبة ChAT.eGFP ، والتي يمكن تمييزها بشكل موثوق باستخدام عرض المحور43. لقد حددنا سابقا محاور الخلايا العصبية الحركية باستخدام الماوس ChAT.eGFP في الجسم الحي43. نحن الآن الإبلاغ عن أن HB9. يمكن أيضا استخدام فئران GFP لتحقيق تحديد محور الخلايا العصبية الحركية في الجسم الحي. في الواقع ، يقدم الشكل 3 سلسلة من الصور ذات الفاصل الزمني ل HB9. محاور GFP تحتوي على إشارات إيجابية HCT-555 تتحرك بأثر رجعي. لاحظ أنه على عكس التعبير المدفوع ب ChAT، فإن GFP لديه نمط أكثر ثقبا/حبيبية في HB9. محاور GFP والسبب في ذلك غير واضح. لقد وصفنا سابقا كيفية مراقبة ديناميكيات الميتوكوندريا في الجسم الحي في الأعصاب الوركية عن طريق حقن العصب داخل الورك من صبغة استهداف الميتوكوندريا ، رباعي ميثيل رودامين ، إستر الإيثيل ، بيركلورات (TMRE) 32,36. للتمييز بشكل موثوق بين الميتوكوندريا الحركية والحسية ، يمكن عبور فأر Mito.CFP ، الذي يعبر عن CFP تحت مروج Thy1 18 ، مع الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن جين مراسل الفلورسنت في أنواع محددة من الخلايا العصبية. في الواقع ، من خلال تربية الفئران Mito.CFP مع الفئران ChAT.tdTomato (المشار إليها باسم ChAT.tdTomato::Mito.CFP) ، يمكننا تصور الميتوكوندريا على وجه التحديد في المحاور الحركية ، كما هو موضح في الشكل 4. في هذا المثال الحي متعدد الإرسال ، يمكن تصور خمسة محاور ChAT.tdTomato ، أربعة منها تحتوي على ميتوكوندريا إيجابية CFP. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تحديد عقدة رانفييه (السهم الأبيض في اللوحة الثالثة). علاوة على ذلك ، يمكن اكتشاف عقد Ranvier بوضوح في ChAT.eGFP ، HB9. الفئران GFP و Mito.CFP (غير معروضة). تمكن هذه السلالات المزدوجة المعدلة وراثيا من التصوير داخل الحيوية بفاصل زمني للفئران الحية المخدرة لمراقبة محتوى الميتوكوندريا الخاصة بالخلايا العصبية الحركية وديناميكيات النقل المحورية. وأخيرا، يمكن تصور إشارات الإندوسومات والميتوكوندريا في وقت واحد داخل نفس المحاور العصبية في الجسم الحي عن طريق حقن HCT في عضلات الفئران Mito.CFP (الشكل 5)”. تم إجراء الحقن العضلي ل HCT-555 في عضلة TA في فأر Mito.CFP ~ 4 ساعات قبل التصوير. تم تصور كل من الميتوكوندريا (الألواح i) و endosomes الإشارات (الألواح ii) في وقت واحد في محاور خاصة بالعضلات (أي محاور عصبية تعصب TA). في الواقع ، يمكن ملاحظة العضيات المتحركة (المثلثات الصفراء) والتراجع (المثلثات والدوائر الخضراء) وكذلك العضيات المتوقفة (المثلثات والدوائر البرتقالية). باستخدام هذا النموذج التجريبي ، يمكن للمرء تقييم التفاعلات الوظيفية المعقدة بين الميتوكوندريا المحورية وإشارات الإندوسومات في الجسم الحي. بشكل عام ، نوضح العديد من الأساليب التجريبية المختلفة لتقييم النقل المحوري للإندوسومات و / أو الميتوكوندريا ، وتحديدا في الخلايا العصبية الحركية الكولينية في الجسم الحي. الشكل 1: المحاور العصبية الوركية الحركية. (أ) صورة تمثيلية أحادية المستوى للمحاور الحركية الموجبة eGFP التي تم الحصول عليها في الجسم الحي من فأر ChAT.eGFP. (ب) صورة تمثيلية أحادية المستوى للمحاور الحركية الموجبة للطماطم في عصب وركي تم استئصاله من فأر ChAT.tdTomato. تنتج الفروق في عيار المحور العصبي عن الاختلافات في عمر الماوس وحجمه. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: eGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. ChAT = الكولين أستيل ترانسفيراز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: النقل المحوري في الجسم الحي للإندوسومات المشيرة في حرك العصب الوركي الحي والخلايا العصبية الحسية لفأر ChAT.eGFP. (A-C) صور تمثيلية للمحاور الكولينية التي تعبر عن eGFP (A) وتحتوي على إشارات إيجابية H C T-555 (B) ، والدمج (C). تسلط الأسهم البيضاء الضوء على محور محرك إيجابي eGFP يحتوي على إندوسومات إشارات إيجابية H C T-555 ، وتحدد الأسهم السماوية محورا حركيا يفتقر إلى إندوسوماتإشارات إيجابية H C T-555 ، وتسلط الأسهم الصفراء الضوء على محور حسي سالب eGFP ينقل إندوسومات إشارات إيجابية HCT-555. تحدد العلامات النجمية البرتقالية المحاور الحركية ذات التعبير eGFP الأضعف. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: eGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. ChAT = الكولين أستيل ترانسفيراز; HCT-555 = مجال ربط سموم الكزاز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: سلسلة صور الفاصل الزمني التي تمثل في الجسم الحي النقل المحوري للإشارات الداخلية في الخلايا العصبية الحركية الحية ل HB9. فأرة GFP. (أ-دال) صور الفاصل الزمني التي يتم التقاطها كل 3 ثوان تصور محاور الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (i) وتحتوي على إشارات HCT-555 إيجابية (ii) ، والدمج (iii). تحدد كل دائرة من نفس اللون نفس الإندوسوم المتحرك عبر إطارات مختلفة. الحركة الرجعية هي من اليمين إلى اليسار. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. HCT-555 = مجال ربط سموم الكزاز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: النقل المحوري للميتوكوندريا في الخلايا العصبية الحركية العصبية الوركية الحية ل ChAT.tdTomato:: Mito.CFP: mouse. (A-C) صور تمثيلية للمحاور الحركية الإيجابية للطماطم (A) ، تحتوي على الميتوكوندريا الإيجابية CFP (B) ، والدمج (C). تحتوي الصور المضمنة i-iii على تكبير أعلى من كل لوحة. يمثل السهم الأبيض عقدة مشتبه بها من رانفييه. أشرطة المقياس = 25 (A-C) و 10 ميكرومتر (i-iii). الاختصارات: ChAT = الكولين أستيل ترانسفيراز; CFP = بروتين الفلورسنت السماوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: سلسلة صور الفاصل الزمني التي تمثل النقل المحوري المتزامن في الجسم الحي للميتوكوندريا وإشارات الإندوسومات في الخلايا العصبية الحركية العصبية الوركية الحية لفأر Mito.CFP. (أ-ج) صور الفاصل الزمني التي تم التقاطها كل 3 ثوان تصور النقل المحوري لكل من الميتوكوندريا (i) وإشارات endosomes (ii) داخل نفس محور العصب الوركي (iii). تحدد المثلثات الصفراء الشحنات المتحركة من الأمام ، وتحدد الدوائر / المثلثات الخضراء الشحنات المتحركة بأثر رجعي ، وتحدد الدوائر / المثلثات البرتقالية الشحنات الثابتة. حركة Anterograde هي من اليسار إلى اليمين ، في حين أن الحركة الرجعية في الاتجاه المعاكس. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: HCT-555 = مجال ربط سموم الكزاز. CFP = بروتين الفلورسنت السماوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يفصل هذا البروتوكول خطوات تقييم النقل المحوري في الجسم الحي للإندوسومات والميتوكوندريا في المحاور العصبية السليمة للعصب الوركي للفأر. في الواقع ، يتم توفير إعداد تجريبي يمكن المستخدمين من 1) التمييز بين الخلايا العصبية الحركية والحسية في الجسم الحي ، في الموقع ، وخارج الجسم الحي باستخدام الفئران التي تعبر عن بروتينات المراسل الفلورسنت التي يتم التعبير عنها بشكل انتقائي في الخلايا العصبية الحركية. 2) تقييم النقل المحوري في الجسم الحي للإشارات endosomes على وجه التحديد في محاور الخلايا العصبية الحركية باستخدام ثلاثة فئران معدلة وراثيا مختلفة ؛ 3) التحقيق في النقل المحوري للميتوكوندريا في الجسم الحي على وجه التحديد في محاور الخلايا العصبية الحركية ؛ و 4) تقييم ديناميكيات النقل في الجسم الحي في وقت واحد من إشارات endosomes والميتوكوندريا داخل نفس المحور العصبي. يتمتع هذا النهج بإمكانات هائلة للتحقيق في النقل المحوري في الظروف القاعدية ويمكن استخدامه لتقييم الاضطرابات المرضية في الأمراض المختلفة التي تؤثر على الأعصاب الحركية والحسية المحيطية.

باستخدام النماذج التجريبية السابقة كأساس31,32 ، لدينا هنا طرق جديدة وقوية مفصلة للتمييز بين النقل المحوري الذي يحدث في الخلايا العصبية الحركية مقابل الحسية باستخدام الفئران المراسلة المعدلة وراثيا. باستخدام فأر Mito.CFP ، تم تطوير هذا النهج لتقييم انتقال الميتوكوندريا في الجسم الحي عن طريق تجنب حقن العصب داخل الورك من TMRE36. هذا يتحايل على الأضرار العصبية المحتملة والاضطرابات في النقل المحوري الناجم عن الحقن داخل الأعصاب للمسبار. علاوة على ذلك ، يسمح هذا البروتوكول بتصور النقل المحوري للعضيات المتعددة في المحاور الحركية التي تعصب العضلات ذات الخصائص الفسيولوجية المتميزة (على سبيل المثال ، العضلات سريعة الارتعاش القابلة للكلل مقابل العضلات المقاومة للتعب البطيئة الارتعاش). على هذا النحو ، يمكن تقييم ديناميكيات النقل المحوري للإندوسوم و / أو الميتوكوندريا في مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا العصبية α الحركية44. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تقييم النقل المحوري لتلك العضيات في البيئات المرضية من خلال التهجين مع نماذج الفئران لمختلف الأمراض العصبية التنكسية1،2،3.

تتوسع مجموعة أدوات النقل المحوري باستمرار28,29 ، وقد تم تطوير بروتوكولات خارج الجسم الحي لتقييم ديناميكيات النقل باستخدام القرن البطني للفأر المستزرعexplants 49 أو الاستعدادات العصبية العضلية للفأرالمستأصل 50. وعلاوة على ذلك، فإن تطوير بروتوكولات لتقييم الانتقال المحوري في الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات المشتقة منالخلايا العصبية القشرية 51 أو الخلايا العصبية الحركية الشوكية المشتقة من hiPSC52 قد مكن من التحقيق في الخلايا العصبية البشرية ذات الطفرات المسببة للأمراض. يمكن أن توفر هذه البروتوكولات المتطورة في أنسجة الفئران والخلايا البشرية رؤى حاسمة في وظيفة الخلايا العصبية ، وتسهل الاكتشاف الباثوميكاني الجديد في نماذج الأمراض العصبية التنكسية ، ويمكن استخدامها لاختبار الجزيئات والاستراتيجيات العلاجية.

ويلزم اتباع عدة خطوات حاسمة من أجل التنفيذ الناجح لهذه التقنيات، وقد قدمت بعض الملاحظات الهامة في قسم البروتوكول. المتطلبات الرئيسية للتصوير داخل الحيوية هي المجهر البؤري المقلوب مع إدراج المرحلة المخصصة والمعدات اللازمة للحفاظ على التخدير ودرجة الحرارة المثلى. في الواقع ، هناك حاجة إلى نظام تخدير متنقل متخصص من أجل 1) تحريض التخدير ، 2) التشريح / معالجة الأنسجة (أي تعريض العصب الوركي) ، و 3) الحفاظ على التخدير أثناء التصوير داخل الحيوية (كما هو مفصل سابقا في 31,32). خاصة عند استخدام أهداف تكبير أعلى (على سبيل المثال ، 40x أو 63x) ، يمكن أن يؤثر عمق التخدير على جودة الصورة ، حيث يحفز التخدير الأعمق أنفاسا “لهثة” كبيرة تؤدي إلى تحولات متكررة في التركيز. ومما لا شك فيه أن مثل هذه الحركات الكبيرة ستؤثر على تحليلات النقل بعد التصوير (على سبيل المثال، تتبع الشحنات باستخدام المكونات الإضافية في فيجي TrackMate53 أو KymoAnalyzer54) حيث تنتج حركات التنفس قطعا أثرية في مقاطع فيديو بفاصل زمني يمكن أن تجعلها غير مناسبة للتتبع الآلي أو تتطلب تقييما أكثر استهلاكا للوقت. علاوة على ذلك ، لاحظنا أيضا القطع الأثرية التصويرية الناجمة عن الشرايين النابضة داخل العصب الوركي ، والتي لا يمكن حلها إلا عن طريق اختيار منطقة تصوير مختلفة. يجب أن يكون المجهر مجهزا بغرفة بيئية قادرة على الحفاظ على درجة حرارة ثابتة للجسم ، حيث تؤثر درجة الحرارة والرقم الهيدروجيني على النقل المحوري55. علاوة على ذلك ، يجب تجنب تطبيق المسكنات بعد الجراحة ، لأنها يمكن أن تغير ديناميكيات النقل56. إذا كان التصميم التجريبي طوليا ويتطلب تصويرا متكررا (على سبيل المثال ، 57) ، فيجب تعديل بروتوكولات التشريح بشكل مناسب لتكون طفيفة التوغل وقد تتطلب موافقة أخلاقية / ترخيص إضافية.

يجب أن تؤخذ بعض الاعتبارات التجريبية في الاعتبار. أولا ، تتضمن معظم البروتوكولات المفصلة هنا استخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تمتلك بروتينات مراسل الفلورسنت في الميتوكوندريا أو محاور الخلايا العصبية الحركية. يجب تربية كل من خطوط الماوس هذه وتصويرها على أنها hemi-/heterozygote. ومع ذلك ، فإن الاستثناءات هي خطوط الماوس ChAT.Cre و Rosa26.tdTomato التي يمكن الحفاظ عليها بشكل منفصل على أنها متماثلة الزيجوت ، مع ذرية hemizygote الناتجة التي تمكن التعبير عن tdTomato في الخلايا العصبية الكولينية بعد إعادة تركيب Cre-loxP. عند تهجين الفئران الهيمي / غير المتجانسة المعدلة وراثيا (على سبيل المثال ، Mito.CFP) مع الفئران الأخرى المعدلة وراثيا من الهيمي / غير المتجانسة (على سبيل المثال ، ChAT.eGFP) ، يحتاج المرء إلى النظر بعناية في استراتيجية التكاثر ، لأن الحصول على الأعداد المطلوبة من النسل المزدوج المتحور يمكن أن يستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، عند تربية جيل F1 من الفئران ChAT.Cre و Rosa26.tdTomato (أي ChAT.tdTomato) مع سلالات إضافية معدلة وراثيا (على سبيل المثال ، Mito.CFP) ، ينبغي للمرء أن يتوقع عددا أقل من الفئران التي تحمل الجينات الثلاثية المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المرء أيضا النظر في التداخل الفلوروفوري المحتمل عند تربية الفئران ذات المراسلين مع خصائص الطول الموجي القريبة (على سبيل المثال ، Mito-CFP-excitation: 435 nm ، الانبعاثات: 485 nm ، المرباة مع ChAT.eGFP-excitation: 488 nm ، الانبعاثات: 510 nm) ، على الرغم من أنه قد يكون من الممكن التغلب على هذه المشكلة مع فك الخلط الطيفي58.

هذه التقنية لديها بعض القيود التي يجب مراعاتها. في هذا العمل وبروتوكولاتنا السابقة31,32 ، أظهرنا كيف يمكن استخدام العديد من العلامات المشفرة وراثيا وطرق التلطيخ المختلفة لتسمية وتتبع العضيات المتميزة في الجسم الحي. ومع ذلك ، ليست كل المجسات مناسبة لهذا النهج التجريبي. قمنا بتقييم الحقن في TA أو العضلة الوحيدة للوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا بيتا (CTB)-488 (0.5-1.5 ميكروغرام / ميكرولتر ~ 4 ساعات قبل التصوير) ، وهو مسبار يستخدم بشكل روتيني لتسمية أجسام الخلايا العصبية الحركية في تجارب التتبع الرجعي في الجسم الحي 59,60. ومع ذلك ، عند حقنه بمفرده أو حقنه مع HCT-555 ، كان وضع العلامات CTB-488 ضعيفا على الرغم من استخدام تركيزات مماثلة لتلك المستخدمة في تتبع الخلايا العصبية الحركية الرجعية بنجاح. وهكذا ، نستنتج أنه على الرغم من أن CTB علامة ممتازة في المختبر للإشارة إلى endosomes في الثقافات العصبية61 ، إلا أن HCT لا يزال المسبار القياسي الذهبي لتحديد الإندوسومات ذات الإشارات في الجسم الحي في محاور الأعصاب الوركية.

باستخدام طرق مختلفة ، اختبرنا أيضا مجسات تستخدم بشكل روتيني لوضع العلامات على الليزوسومات ، مثل LysoTracker Green DND-26 ، وعلامات هيدرولاز الليزوزومات النشطة ، مثل BODIPY-FL-pepstatin A ل Cathepsin D62 و Magic Red ل Cathepsin B ، ولكن دون نجاح. حاولنا التسليم العضلي ل BODIPY-FL-pepstatin A (2.5 ميكروغرام في TA ~ 4 h قبل التصوير) ، وكذلك حقن العصب الوركي من 2 ميكرولتر من LysoTracker (10 ميكرومتر) ، bodipy-fl-pepstatin A (10 μM) أو Magic Red (1/10) 30-60 دقيقة قبل التصوير. على الرغم من هذه المجسات التي تسلط الضوء على العصب ، لم نتمكن من العثور على عضيات تحمل علامات واضحة. تراكمت المجسات حول المحاور العصبية ، ومن المحتمل أن تحتفظ بها خلايا شوان. وبالتالي ، قد يكون وضع العلامات غير الناجح على الليزوزومات بسبب نقص توصيل المسبار إلى الخلايا العصبية ، على الرغم من أنه لا يمكن استبعاد وجود تركيزات أكثر ملاءمة. بالنظر إلى أن وضع العلامات TMRE يعمل في ظل ظروف مماثلة (أي حقن العصب داخل الورك) ، فقد تكون كثافة وضع العلامات معتمدة على الصبغة ويجب اختبارها لكل علامة بشكل مستقل. ومع ذلك ، فإننا نستنتج أن استهداف الليزوسومات في الجسم الحي بهذه المجسات غير ممكن في التركيزات المذكورة أعلاه.

يمكن لطرق التخدير أن تغير القراءات الفسيولوجية المتميزة (على سبيل المثال ، وظيفة القوقعة63 والفيزيولوجيا الكهربية القشرية64) ؛ ومع ذلك ، ما إذا كان التخدير يؤثر في النقل المحوري في الجسم الحي في العصب الوركي غير معروف حاليا. بالنظر إلى انخفاض النشاط العصبي العضلي تحت التخدير الناجم عن الأيزوفلوران ، فمن الممكن أن تختلف حركية النقل مقارنة بحالة اليقظة. ومع ذلك ، فإن الدراسة الوحيدة في الجسم الحي التي حققت مباشرة في هذا كشفت أن نقل الحويصلات الأساسية الكثيفة في الإسقاطات القشرية المهادية لا يختلف بين الفئران المخدرة واليقظة65. وعلاوة على ذلك، ولأن الفروق في النقل بين الفئران من النوع البري والفئران النموذجية للأمراض يمكن اكتشافها تحت التخدير 35,43، فمن الواضح أن التعرض للإيسوفلوران لا يمنع تحديد البيربيربانسيس في الإشارة إلى الاتجار بالإندوسوم أو الميتوكوندريا.

يحتوي هذا البروتوكول على تطبيقات محتملة أخرى ، والتي تم وصفها أدناه. إن تربية الفئران المعدلة وراثيا الموضحة في هذا البروتوكول (على سبيل المثال ، Mito.CFP ، ChAT.eGFP) مع نماذج فئران الأمراض العصبية التنكسية1،2،3 ستمكن من إجراء تحقيقات خاصة بالنوع الفرعي للخلايا العصبية و / أو البضائع. علاوة على ذلك ، فإن خطوط Cre66 للفئران التي تم تطويرها مؤخرا ستسمح أيضا بتصور بروتينات مراسل الفلورسنت في مجموعات محورية حسية متميزة. على سبيل المثال ، يمكن عبور الفئران Rosa26.tdTomato مع مستقبلات neuropeptide Y -2-التعبير (Npy2r). فأر Cre لتمكين تألق tdTomato في مستقبلات الألياف A المينوية67. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تحقيق التحكم الزمني باستخدام أنظمة Cre المستحثة (على سبيل المثال ، تاموكسيفين)68. وهناك تطبيق محتمل آخر يعتمد على توافر الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات المراسل الفلورسنت في خلايا شوان. في الواقع ، تمكن الفئران S100-GFP69 و PLP-GFP70 من التصوير في الجسم الحي و / أو في الموقع لخلايا Schwann وكانت في طليعة الأبحاث المشاركة في هجرة خلايا Schwann أثناء تجديد الأعصاب الطرفية.

بالإضافة إلى هذه التطبيقات واستكمال الماوس Mito.CFP هو توافر العديد من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في عضيات متميزة ، مثل الميتوكوندريا و autophagosomes. على سبيل المثال ، قد يكون من الممكن التحقيق في نقل الميتوكوندريا في الجسم الحي باستخدام ماوس mito::mKate271 أو ماوس mitoDendra57 القابل للتحويل الضوئي. علاوة على ذلك ، قد يكون النقل في الجسم الحي mitophagosome ممكنا باستخدام ماوس mito-Keima الحساس لدرجةالحموضة 72 وماوس mito-QC73 لتحليلات mitophagy. علاوة على ذلك ، يمكن التغلب على صعوبات وضع العلامات الليزوزومية التي واجهناها باستخدام الفئران التي تعبر عن LAMP1-GFP ، مع التحذير من أن LAMP1 موجود أيضا في عضيات الخلايا الداخلية المتميزة عن الليزوسومات74.

باختصار ، قدمنا طرقا جديدة لتقييم النقل المحوري في الجسم الحي للعديد من العضيات في محاور عصبية محيطية محددة من الفئران المعدلة وراثيا المتنوعة. سيكون التصوير المتزامن للعضيات المختلفة مهما بشكل خاص ، بالنظر إلى النتائج الأخيرة للتفاعلات المحورية والاتجار المشترك بالعضيات مثل الميتوكوندريا والإندوسومات75,76. نعتقد أن الطرق المقدمة ستكون مفيدة لتحسين فهم الفسيولوجيا القاعدية للمحاور العصبية في الجسم الحي وفك تشابك الآليات المرضية المهمة التي تقود التنكس العصبي للأعصاب الطرفية.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر روبرت براونستون (معهد كوين سكوير لطب الأعصاب ، كلية لندن الجامعية) على مشاركة الفئران ChAT-eGFP و ChAT.Cre و Rosa26.tdTomato ، وبيترو فراتا (معهد كوين سكوير لطب الأعصاب ، كلية لندن الجامعية) لمشاركة HB9. فأرة GFP. نود أن نشكر إيلينا ر. رايمز وشارلوت جي بي كريمرز وكيوهان لانغ (معهد كوين سكوير لطب الأعصاب ، كلية لندن الجامعية) على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال زمالة غير سريرية للمبتدئين من جمعية أمراض الخلايا العصبية الحركية (المملكة المتحدة) (Tosolini / Oct20/973-799) (APT) ، وجوائز Wellcome Trust لكبار الباحثين (107116/Z/15/Z و 223022/Z/21/Z) (GS) ، وجائزة مؤسسة معهد أبحاث الخرف في المملكة المتحدة (GS) ؛ وجائزة مجلس البحوث الطبية للتطوير الوظيفي (MR/S006990/1) (JNS).

Materials

0.2 mL PCR tube
70% (v/v) ethanol in distilled water
AlexaFlour555 C2 maleimide ThermoFisher Scientific A-20346 Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J Jackson Laboratory 7909 Rosa26.tdTomato mice
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice Jackson Laboratory 5029 HB9.GFP mice
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice Jackson Laboratory 7967 Mito.CFP mice
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice Jackson Laboratory 6410 ChAT.Cre mice
Computer with microscope control and image acquisition software Zeiss Zen
Cotton swab
Desktop centrifuge
Dissecting microscope
Eye lubricant
Fine curved forceps Dumont
Fine straight forceps Dumont
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1)
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger Drummond Scientific 5-000-1001-X10
Hair clippers
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) Merck 20779
HcT-441 N/A N/A See Restani et al., 2012 for more details
Heating pad
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C
Inverted confocal microscope with environmental chamber Zeiss LSM 780 Most inverted confocals should be adaptable
Isoflurane
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer
Magic tape invisible tape
Micropipette puller
Parafilm Parafilm
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 BDNF that can be used to co-inject with HcT-555
Saline
Scalpel blade Dumont
Small spring scissors Dumont
Surgery/operating microscope
Surgical drape
Surgical suture
Surgical tape
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice MMRRC 000296-UCD ChAT.eGFP
Vortex mixer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  2. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models & Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  3. De Giorgio, F., Maduro, C., Fisher, E. M. C., Acevedo-Arozena, A. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037424 (2019).
  4. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. The Journal of Cell Biology. 187 (6), 761-772 (2009).
  5. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  6. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  7. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiological Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
  8. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 482 (2), 123-141 (2005).
  9. Kaiser, T., Ting, J. T., Monteiro, P., Feng, G. Transgenic labeling of parvalbumin-expressing neurons with tdTomato. Neurociência. 321, 236-245 (2016).
  10. Zheng, B., Sage, M., Sheppeard, E. A., Jurecic, V., Bradley, A. Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Molecular and Cellular Biology. 20 (2), 648-655 (2000).
  11. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  12. Bareyre, F. M., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Sanes, J. R. Transgenic labeling of the corticospinal tract for monitoring axonal responses to spinal cord injury. Nature Medicine. 11 (12), 1355-1360 (2005).
  13. Willems, J., et al. A CRISPR/Cas9-based genome editing toolbox for epitope tagging of endogenous proteins in neurons. PLoS Biology. 18 (4), 3000665 (2020).
  14. Huh, Y., Oh, M. S., Leblanc, P., Kim, K. -. S. Gene transfer in the nervous system and implications for transsynaptic neuronal tracing. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (5), 763-772 (2010).
  15. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: an approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Scientific Reports. 6, 33058 (2016).
  16. Andrews, M. R. Gene therapy in the CNS-one size does not fit all. Gene Therapy. 28 (7-8), 393-395 (2021).
  17. Kügler, S. Tissue-specific promoters in the CNS. Methods in Molecular Biology. 1382, 81-91 (2016).
  18. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  19. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  20. Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), 108697 (2014).
  21. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  22. Maday, S., Twelvetrees, A. E., Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. F. Axonal transport: cargo-specific mechanisms of motility and regulation. Neuron. 84 (2), 292-309 (2014).
  23. Terenzio, M., Schiavo, G., Fainzilber, M. Compartmentalized signaling in neurons: from cell biology to neuroscience. Neuron. 96 (3), 667-679 (2017).
  24. Abouward, R., Schiavo, G. Walking the line: mechanisms underlying directional mRNA transport and localisation in neurons and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2665-2681 (2021).
  25. Sleigh, J. N., Rossor, A. M., Fellows, A. D., Tosolini, A. P., Schiavo, G. Axonal transport and neurological disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 691-703 (2019).
  26. Bronfman, F. C., Moya-Alvarado, G. BDNF/TrkB signaling endosomes mediate long-distance dendritic growth by activating CREB/PI3K-mTOR-dependent translation in neuronal cell bodies. BioRxiv. , (2020).
  27. Nagano, S., Araki, T. Axonal Transport and Local Translation of mRNA in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 697973 (2021).
  28. Boecker, C. A., Olenick, M. A., Gallagher, E. R., Ward, M. E., Holzbaur, E. L. F. ToolBox: Live Imaging of intracellular organelle transport in induced pluripotent stem cell-derived neurons. Traffic. 21 (1), 138-155 (2020).
  29. Surana, S., et al. The evolution of the axonal transport toolkit. Traffic. 21 (1), 13-33 (2020).
  30. Sleigh, J. N., Vagnoni, A., Twelvetrees, A. E., Schiavo, G. Methodological advances in imaging intravital axonal transport. F1000Research. 6, 200 (2017).
  31. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  32. Sleigh, J. N., Tosolini, A. P., Schiavo, G. In vivo imaging of anterograde and retrograde axonal transport in rodent peripheral nerves. Methods in Molecular Biology. 2143, 271-292 (2020).
  33. Gibbs, K. L., et al. Inhibiting p38 MAPK alpha rescues axonal retrograde transport defects in a mouse model of ALS. Cell Death & Disease. 9 (6), 596 (2018).
  34. Fellows, A. D., Rhymes, E. R., Gibbs, K. L., Greensmith, L., Schiavo, G. IGF1R regulates retrograde axonal transport of signalling endosomes in motor neurons. EMBO Reports. 21 (3), 49129 (2020).
  35. Bilsland, L. G., Sahai, E., Kelly, G., Golding, M., Greensmith, L., Schiavo, G. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (47), 20523-20528 (2010).
  36. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. The Journal of Cell Biology. 218 (6), 1871-1890 (2019).
  37. Bercsenyi, K., et al. Tetanus toxin entry. Nidogens are therapeutic targets for the prevention of tetanus. Science. 346 (6213), 1118-1123 (2014).
  38. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293-305 (2006).
  39. Debaisieux, S., Encheva, V., Chakravarty, P., Snijders, A. P., Schiavo, G. Analysis of signaling endosome composition and dynamics using SILAC in embryonic stem cell-derived neurons. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 542-557 (2016).
  40. Surana, S., et al. The travel diaries of tetanus and botulinum neurotoxins. Toxicon. 147, 58-67 (2018).
  41. Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Lazo, O. M. The many disguises of the signalling endosome. FEBS Letters. 592 (21), 3615-3632 (2018).
  42. Malik, B., et al. Absence of disturbed axonal transport in spinal and bulbar muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 20 (9), 1776-1786 (2011).
  43. Sleigh, J. N., et al. Mice carrying ALS mutant TDP-43, but not mutant FUS, display in vivo defects in axonal transport of signaling endosomes. Cell Reports. 30 (11), 3655-3662 (2020).
  44. Tosolini, A. P., Sleigh, J. N., Surana, S., Rhymes, E. R., Cahalan, S. D., Schiavo, G. modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. BioRxiv. , (2021).
  45. Restani, L., et al. Botulinum neurotoxins A and E undergo retrograde axonal transport in primary motor neurons. PLoS Pathogens. 8 (12), 1003087 (2012).
  46. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52846 (2015).
  47. Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Frontiers in Neurology. 4, 58 (2013).
  48. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neurociência. 274, 318-330 (2014).
  49. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60993 (2020).
  50. Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61264 (2020).
  51. Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. -. J. Analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60548 (2020).
  52. Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), e62959 (2021).
  53. Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  54. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  55. Bohnert, S., Schiavo, G. Tetanus toxin is transported in a novel neuronal compartment characterized by a specialized pH regulation. The Journal of Biological Chemistry. 280 (51), 42336-42344 (2005).
  56. Kanai, A., et al. Low-concentration lidocaine rapidly inhibits axonal transport in cultured mouse dorsal root ganglion neurons. Anesthesiology. 95 (3), 675-680 (2001).
  57. Bolea, I., Gan, W. -. B., Manfedi, G., Magrané, J. Imaging of mitochondrial dynamics in motor and sensory axons of living mice. Methods in Enzymology. , 97-110 (2014).
  58. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Multispectral live-cell imaging. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 46 (2018).
  59. Blum, J. A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons. Nature Neuroscience. 24 (4), 572-583 (2021).
  60. Xu, J., et al. An approach to maximize retrograde transport based on the spatial distribution of motor endplates in mouse hindlimb muscles. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 707982 (2021).
  61. Wang, T., et al. Flux of signalling endosomes undergoing axonal retrograde transport is encoded by presynaptic activity and TrkB. Nature Communications. 7, 12976 (2016).
  62. Chen, C. S., Chen, W. N., Zhou, M., Arttamangkul, S., Haugland, R. P. Probing the cathepsin D using a BODIPY FL-pepstatin A: applications in fluorescence polarization and microscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 42 (3), 137-151 (2000).
  63. Cederholm, J. M. E., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hearing Research. 292 (1-2), 71-79 (2012).
  64. Michelson, N. J., Kozai, T. D. Y. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
  65. Knabbe, J., Nassal, J. P., Verhage, M., Kuner, T. Secretory vesicle trafficking in awake and anaesthetized mice: differential speeds in axons versus synapses. The Journal of Physiology. 596 (16), 3759-3773 (2018).
  66. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  67. Arcourt, A., et al. Touch receptor-derived sensory information alleviates acute pain signaling and fine-tunes nociceptive reflex coordination. Neuron. 93 (1), 179-193 (2017).
  68. Valny, M., Honsa, P., Kirdajova, D., Kamenik, Z., Anderova, M. Tamoxifen in the mouse brain: implications for fate-mapping studies using the tamoxifen-inducible Cre-loxP system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 243 (2016).
  69. Hayashi, A., et al. A double-transgenic mouse used to track migrating Schwann cells and regenerating axons following engraftment of injured nerves. Experimental Neurology. 207 (1), 128-138 (2007).
  70. Chen, B., Chen, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. -. P. Analysis of schwann cell migration and axon regeneration following nerve injury in the sciatic nerve bridge. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 308 (2019).
  71. Barrasso, A. P., Tong, X., Poché, R. A. The mito::mKate2 mouse: A far-red fluorescent reporter mouse line for tracking mitochondrial dynamics in vivo. Genesis. 56 (2), (2018).
  72. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  73. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. The Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  74. Cheng, X. -. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. The Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  75. Cioni, J. -. M., Lin, J. Q., et al. Late Endosomes Act as mRNA Translation Platforms and Sustain Mitochondria in Axons. Cell. 176 (12), 56 (2019).
  76. Liao, Y. -. C., Fernandopulle, M. S., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179 (1), (2019).

Tags

In Vivo ImagingAxonal TransportSignaling EndosomesMitochondriaPeripheral NeuronsMotor Disease ModelsAgingGlass MicropipetteIntramuscular InjectionsTibialis Anterior MuscleTetanus NeurotoxinSciatic Nerve

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport. J. Vis. Exp. (178), e63471, doi:10.3791/63471 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image