Ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir o comportamento da dor em camundongos
Summary
O ensaio mecânico de prevenção de conflitos é usado como uma leitura não reflexiva da sensibilidade à dor em camundongos que podem ser usados para entender melhor as respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato.
Abstract
A dor compreende tanto as dimensões sensorial (nociceptiva) quanto afetivas (desagradáveis). Em modelos pré-clínicos, a dor tem sido tradicionalmente avaliada por meio de testes reflexivos que permitem inferências em relação ao componente nociceptivo da dor, mas fornecem poucas informações sobre o componente afetivo ou motivacional da dor. Desenvolver testes que capturem esses componentes da dor são, portanto, traduções importantes. Assim, os pesquisadores precisam usar ensaios comportamentais não reflexivos para estudar a percepção da dor nesse nível. A prevenção de conflitos mecânicos (MCA) é um ensaio de comportamento voluntário não reflexivo estabelecido, por estudar respostas motivacionais a um estímulo mecânico nocivo em um paradigma de 3 câmaras. Uma mudança na preferência de localização de um rato, quando confrontada com estímulos nocivos concorrentes, é usada para inferir o descontentamento percebido da luz brilhante versus estimulação tátil das patas. Este protocolo descreve uma versão modificada do ensaio mca que os pesquisadores da dor podem usar para entender respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato. Embora não seja especificamente descrito aqui, nossos dados mca exemplo usar o intraplantar complete Freund’s adjuvante (CFA), poupado lesão nervosa (SNI) e um modelo de fratura/fundição como modelos de dor para ilustrar o procedimento mca.
Introduction
A dor é uma experiência complexa com componentes sensoriais e afetivos. Uma redução no limiar da percepção da dor e da hipersensibilidade aos estímulos térmicos e/ou mecânicos são características fundamentais dessa experiência, que os testes de comportamento de dor evocados por estímulos podem capturar (como o teste de hargreaves de sensibilidade térmica e o teste von Frey de sensibilidade mecânica)1,2. Embora tais testes dêem resultados robustos e reprodutíveis, eles são limitados por sua dependência da retirada reflexiva de um estímulo nocivo percebido. Isso pôs em causa uma dependência contínua da pesquisa de dor apenas nestes testes. Para isso, os pesquisadores da dor vêm explorando há vários anos testes comportamentais alternativos/complementares para uso em modelos de dor de roedores, em um esforço para capturar mais dos componentes afetivos e/ou motivacionais da dor. Essas medidas não evocadas, voluntárias ou não reflexivas (por exemplo, corrida de rodas, atividade de escavação, preferência de localcondicionada 3,4,5) estão sendo implementadas na tentativa de melhorar a tradução da pesquisa de dor pré-clínica.
O ensaio de prevenção de conflitos mecânicos (MCA) foi originalmente descrito por Harte et al. em2016 6, é usado predominantemente em ratos 7,8, e representa uma modificação de uma abordagem anterior – o paradigma de fuga do local. Nesta abordagem, um estímulo nocivo da pata traseira é realizado em uma câmara de outra forma desejável (escura) para conduzir o comportamento proposital do animal para escapar/evitar tal estimulação 9,10. Em vez de depender de uma estimulação nociva manual da pata traseira por um observador, o ensaio da MCA força os ratos a negociar um estímulo potencialmente nocivo para escapar de um ambiente aversivo e alcançar a câmara escura. O conflito/evasão que dá nome ao ensaio surge dessas duas motivações concorrentes: escapar de áreas iluminadas e evitar estímulos nocivos das patas. O ensaio mca também compartilha características com testes de preferência de local condicionado, onde o emparelhamento do alívio da dor com pistas ambientais impulsiona mudanças de comportamento que refletem uma preferência pelo contexto de alívio/recompensa da dor11.
Fundamentalmente falando, todos esses ensaios compartilham uma abordagem semelhante: usando uma mudança na preferência de um animal por um ambiente aversivo sobre outro como um indicador de seu estado afetivo/motivacional. O ensaio mca é um paradigma de 3 câmaras que consiste em uma câmara iluminada brilhantemente seguido por uma câmara média escura com sondas de altura ajustáveis e uma terceira câmara escura sem qualquer estímulo aversivo. Um rato ileso é tipicamente motivado a escapar para uma câmara escura, dada a aversão inata de roedores à luz brilhante12. Neste exemplo, a motivação natural para escapar de um ambiente iluminado supera a desinclinação ao encontrar estimulação da pata traseira (as sondas de altura ajustáveis), que ocorre exclusivamente no ambiente escurecido. Em contraste, um rato que experimenta dor (devido à inflamação ou neuropatia, por exemplo) pode optar por passar mais tempo no ambiente iluminado, já que há motivação para evitar a desagradável experiência tátil das sondas mecânicas no cenário de hipersensibilidade tátil contínua.
Este artigo descreve uma versão modificada do ensaio mca. Adaptamos o método original (que foi realizado em ratos6) para uso em camundongos. Também reduzimos o número de alturas da sonda testadas de seis para três (0, 2 e 5 mm acima da altura do piso) para agilizar a aquisição de dados. Essa abordagem foi testada em vários modelos de dor e validada com analgésicos conhecidos, indicando que a hipersensibilidade da dor e/ou as alterações afetivas e motivacionais associadas estão conduzindo essas mudanças de comportamento. Essa abordagem é relativamente rápida de conduzir e adaptável quando comparada a outras medidas não reflexivas, que podem levar muitos dias de habituação e treinamento 1,2. Em conjunto com outras medidas de dor, a MCA pode gerar insights valiosos sobre os aspectos afetivos e motivacionais da dor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como em todos os testes comportamentais, o manuseio adequado, a randomização e a cegueira ao tratamento dos animais são essenciais em todos os momentos. Dadas as insumos multifatoriais em comportamentos complexos e tomada de decisões, é imperativo que os animais sejam manuseados, habituados e testados da forma mais consistente possível, minimizando a angústia. Deve-se também ter cuidado para reproduzir o tempo de colocação do mouse na câmara 1, ligar as luzes LED e remover a barreira, uma vez que as diferença…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A GM é apoiada por uma Bolsa de Pós-Graduação NDSEG. O VLT é apoiado pela concessão do NIH NIGMS #GM137906 e pela Fundação Rita Allen. A AJS é apoiada pelo Departamento de Defesa concede W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 e a Fundação Rita Allen. Somos gratos ao Dr. Alexxai Kravitz da Faculdade de Medicina da Universidade de Washington por projetar e disponibilizar gratuitamente os arquivos de impressora 3D para a placa de piso e sonda da câmara 2.
Materials
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red – 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White – 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
Referências
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