cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우
Summary
이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.
Abstract
계측 및 이미지 처리 소프트웨어의 최근 발전으로 인해 단일 입자 냉동 전자 현미경 (cryo-EM)은 구조 생물 학자들이 다양한 거대 분자의 고해상도 구조를 결정하는 데 선호되는 방법이되었습니다. 이미지 처리 및 구조 계산을 위해 신규 및 전문 사용자가 여러 소프트웨어 제품군을 사용할 수 있으며, 이는 동일한 기본 워크플로우를 간소화합니다: 현미경 검출기로 획득한 동영상은 빔 유도 동작 및 콘트라스트 전달 기능(CTF) 추정을 위해 보정을 거칩니다. 다음으로, 반복적인 2D 및 3D 분류를 위해 평균화된 무비 프레임에서 파티클 이미지를 선택하고 추출한 다음, 3D 재구성, 구체화 및 검증이 이어집니다. 다양한 소프트웨어 패키지가 서로 다른 알고리즘을 사용하고 작동하려면 다양한 수준의 전문 지식이 필요하기 때문에 생성되는 3D 맵은 종종 품질과 해상도가 다릅니다. 따라서 사용자는 최적의 결과를 위해 다양한 프로그램간에 정기적으로 데이터를 전송합니다. 이 백서에서는 사용자가 널리 사용되는 소프트웨어 패키지인 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3에서 워크플로를 탐색하여 아데노 관련 바이러스(AAV)의 거의 원자 분해능 구조를 얻을 수 있는 가이드를 제공합니다. 먼저 cryoSPARC v3를 사용하여 이미지 처리 파이프라인을 자세히 설명하는데, 효율적인 알고리즘과 사용하기 쉬운 GUI를 통해 사용자가 3D 맵에 빠르게 도착할 수 있기 때문입니다. 다음 단계에서는 PyEM 및 사내 스크립트를 사용하여 cryoSPARC v3에서 얻은 최고 품질의 3D 재구성에서 RELION-3 및 Scipion 3으로 입자 좌표를 변환 및 전송하고 3D 맵을 다시 계산합니다. 마지막으로, RELION-3 및 Scipion 3의 알고리즘을 통합하여 결과 구조를 더욱 구체화하고 검증하기 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 이 기사에서는 세 가지 처리 플랫폼을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위해 다양한 데이터 세트에 적용 할 수있는 강력하고 강력한 단일 워크 플로우를 만드는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
Cryo-electron microscopy (cryo-EM) 및 single-particle analysis (SPA)는 수화 상태에서 다양한 생체 분자 어셈블리의 구조 결정을 가능하게하여 원자 세부 사항에서 이러한 거대 분자의 역할을 조명하는 데 도움이됩니다. 현미경 광학, 컴퓨터 하드웨어 및 이미지 처리 소프트웨어의 개선으로 2 Å1,2,3 이상의 해상도에서 생체 분자의 구조를 결정할 수있었습니다. 2020년에 2,300개 이상의 cryo-EM 구조물이 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 기탁되었으며, 이는 20144년의 192개 구조물과 비교하여, cryo-EM이 많은 구조 생물학자들이 선택하는 방법이 되었음을 나타냅니다. 여기서는 고해상도 구조 결정을 위해 세 가지 SPA 프로그램을 결합하는 워크플로에 대해 설명합니다(그림 1).
SPA의 목표는 현미경 검출기로 기록된 시끄러운 2D 이미지에서 대상 시편의 3D 볼륨을 재구성하는 것입니다. 탐지기는 동일한 시야각의 개별 프레임을 가진 동영상으로 이미지를 수집합니다. 샘플을 보존하기 위해, 프레임은 낮은 전자 선량으로 수집되고, 따라서 불량한 신호 대 잡음비(SNR)를 갖는다. 추가적으로, 전자 노출은 유리화된 cryo-EM 격자 내의 움직임을 유도할 수 있고, 이로 인해 이미지 블러링이 발생할 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해 프레임은 빔 유도 모션을 보정하도록 정렬되고 평균화되어 SNR이 증가한 현미경 사진을 생성합니다. 이 현미경은 현미경에 의해 부과 된 초점 저하 및 수차의 효과를 설명하기 위해 대비 전달 함수 (CTF) 추정을 거칩니다. CTF 보정 현미경 사진에서 개별 입자를 선택, 추출 및 유리체 얼음에서 시편에 채택 된 다양한 방향을 나타내는 2D 클래스 평균으로 분류됩니다. 결과적인 균질 입자 세트는 거친 모델 또는 모델을 생성하기 위해 ab initio 3D 재구성을 위한 입력으로 사용되며, 이 패턴은 하나 이상의 고해상도 구조를 생성하기 위해 반복적으로 정제됩니다. 재구성 후, cryo-EM 맵의 품질과 해상도를 더욱 향상시키기 위해 구조 개선이 수행됩니다. 마지막으로, 원자 모델이 맵에서 직접 파생되거나 맵에 다른 곳에서 얻은 원자 좌표가 장착되어 있습니다.
Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 등을 포함하여 위에서 설명한 작업을 수행하기 위해 다양한 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다. 이러한 프로그램은 유사한 처리 단계를 따르지만 입자를 선택하고, 초기 모델을 생성하고, 재구성을 구체화하는 등 다양한 알고리즘을 사용합니다. 또한 이러한 프로그램은 작동하기 위해 다양한 수준의 사용자 지식과 개입이 필요하며, 일부는 새로운 사용자에게 장애물 역할을 할 수있는 매개 변수의 미세 조정에 달려 있습니다. 이러한 불일치로 인해 플랫폼 전반에 걸쳐 품질과 해상도가 일관되지 않은 맵이 생기는 경우가 많으며14, 많은 연구자가 여러 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 개선하고 검증해야 합니다. 이 기사에서는 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3을 사용하여 유전자 치료에 널리 사용되는 벡터 인 AAV의 고해상도 3D 재구성을 얻습니다15. 앞서 언급 한 소프트웨어 패키지는 학술 사용자에게 무료입니다. cryoSPARC v3 및 Scipion 3에는 라이선스가 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 고해상도 3D 재구성을 달성하기 위해 다양한 소프트웨어 플랫폼에서 cryo-EM 데이터 처리를 위한 강력한 SPA 워크플로우를 제시합니다(그림 1). 이 워크플로우는 다양한 생물학적 거대분자에 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 단계는 무비 전처리, 입자 채집 및 분류, 구조 미세화를 위한 여러 방법(표 1) 및 검증을 포함하여 <strong class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Scipion3 설치에 도움을 주신 Carlos Oscar Shorzano와 Kilian Schnelle과 Arne Moeller에게 서로 다른 처리 플랫폼 간의 데이터 전송에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구의 일부는 NIH 보조금 U24GM129547에 의해 지원되었으며 OHSU의 PNCC에서 수행되었으며 생물 및 환경 연구 사무소가 후원하는 DOE 과학 사용자 시설 사무소 인 EMSL (grid.436923.9)을 통해 액세스했습니다. 이 연구는 Rutgers University에서 Arek Kulczyk에 대한 창업 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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