תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion
Summary
מאמר זה מתאר כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד קריו-EM, כלומר, cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3, כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים של חלקיקים בודדים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.
Abstract
ההתפתחויות האחרונות הן בתוכנות מכשור והן בתוכנת עיבוד תמונה הפכו מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון של חלקיק יחיד (קריו-EM) לשיטה המועדפת על ביולוגים מבניים לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של מגוון רחב של מקרומולקולות. חבילות תוכנה מרובות זמינות למשתמשים חדשים ומומחים לעיבוד תמונה וחישוב מבנה, המייעלים את אותה זרימת עבודה בסיסית: סרטים שנרכשו על ידי גלאי המיקרוסקופ עוברים תיקון להערכת תנועה והעברת ניגודיות (CTF) הנגרמת על ידי קרן. לאחר מכן, תמונות חלקיקים נבחרות ומופקות ממסגרות סרט ממוצעות לסיווג דו-ממדי ותלת-ממדי איטראטיבי, ולאחר מכן שחזור, עידון ואימות תלת-ממדיים. מכיוון שחבילות תוכנה שונות משתמשות באלגוריתמים שונים ודורשות רמות שונות של מומחיות כדי לפעול, המפות התלת-ממדיות שהן מייצרות שונות לעתים קרובות באיכות וברזולוציה. לכן, משתמשים באופן קבוע להעביר נתונים בין מגוון רחב של תוכניות לקבלת תוצאות אופטימליות. מאמר זה מספק מדריך למשתמשים לנווט בזרימת עבודה על פני חבילות התוכנה הפופולריות: cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3 כדי לקבל מבנה רזולוציה כמעט אטומית של הווירוס הקשור לאדנו (AAV). אנו מפרטים תחילה צינור עיבוד תמונה עם cryoSPARC v3, שכן האלגוריתמים היעילים שלו ו- GUI קל לשימוש מאפשרים למשתמשים להגיע במהירות למפה תלת-ממדית. בשלב הבא, אנו משתמשים ב- PyEM ובסקריפטים פנימיים כדי להמיר ולהעביר קואורדינטות חלקיקים מהשחזור התלת-ממדי האיכותי ביותר המתקבל ב- cryoSPARC v3 ל- RELION-3 ו- Scipion 3 ולחשב מחדש מפות תלת-ממדיות. לבסוף, אנו מתארים שלבים לעידון נוסף ואימות של המבנים המתקבלים על ידי שילוב אלגוריתמים מ- RELION-3 ו- Scipion 3. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.
Introduction
מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) וניתוח חלקיקים בודדים (SPA) מאפשרים קביעת מבנה של מגוון רחב של מכלולים ביו-מולקולריים במצבם הלחותי, ומסייעים להאיר את תפקידיהם של מקרומולקולות אלה בפירוט אטומי. שיפורים במיקרוסקופ אופטיקה, חומרת מחשב, ותוכנה לעיבוד תמונה אפשרו לקבוע מבנים של ביומולקולות ברזולוציה להגיע מעבר 2 Å1,2,3. יותר מ-2,300 מבני קריו-EM הופקדו במאגר נתוני החלבון (PDB) ב-2020, לעומת 192 מבנים ב-2014, מה שמצביע על כך שהקפאה-EM הפכה לשיטת הבחירה של ביולוגים מבניים רבים. כאן אנו מתארים זרימת עבודה המשלבת שלוש תוכניות ספא שונות לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה (איור 1).
המטרה של SPA היא לשחזר אמצעי אחסון תלת-ממדיים של דגימת יעד מתמונות דו-ממדיות רועשות שנרשמו על ידי גלאי מיקרוסקופ. גלאים אוספים תמונות כסרטים עם מסגרות בודדות של אותו שדה ראייה. על מנת לשמר את המדגם, מסגרות נאספים עם מינון אלקטרונים נמוך ולכן יש יחס אות לרעש גרוע (SNR). בנוסף, חשיפה לאלקטרונים יכולה לגרום לתנועה בתוך רשתות ההקפאה-EM המיובשות, וכתוצאה מכך טשטוש תמונה. כדי להתגבר על בעיות אלה, מסגרות מיושרות כדי לתקן עבור תנועה הנגרמת על ידי קרן וממוצע להניב מיקרוגרף עם SNR מוגבר. מיקרוגרפים אלה עוברים הערכה של פונקציית העברת ניגודיות (CTF) כדי להסביר את ההשפעות של דפוקוס וסטיות שהוטלו על ידי המיקרוסקופ. מהמיקרוגרפים המתוקנים של CTF, חלקיקים בודדים נבחרים, מופקים ומוינים לממוצעים דו-ממדיים המייצגים אוריינטציות שונות שאומצו על ידי הדגימה בקרח זגוגי. קבוצת החלקיקים ההומוגנית שנוצרת משמשת כקלט לשחזור תלת-ממדי ab initio כדי ליצור מודל או מודלים גסים, אשר לאחר מכן מעודנים באופן איטרטיבי כדי לייצר מבנה אחד או יותר ברזולוציה גבוהה. לאחר השחזור, שיפורים מבניים מבוצעים כדי לשפר עוד יותר את האיכות והרזולוציה של מפת cryo-EM. לבסוף, מודל אטומי נגזר ישירות מהמפה, או שהמפה מצוידת בקואורדינטות אטומיות המתקבלות במקום אחר.
חבילות תוכנה שונות זמינות כדי להשלים את המשימות המתוארות לעיל, כולל Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, ואחרים. בעוד שתוכניות אלה מבצעות שלבי עיבוד דומים, הן משתמשות באלגוריתמים שונים, לדוגמה, כדי לבחור חלקיקים, ליצור מודלים ראשוניים ולמקד שחזורים. בנוסף, תוכניות אלה דורשות רמה משתנה של ידע משתמש והתערבות לפעול, כמו כמה תלויים כוונון עדין של פרמטרים שיכולים לשמש משוכה עבור משתמשים חדשים. אי-התאמות אלה גורמות לעתים קרובות למפות עם איכות ורזולוציה לא עקביות בפלטפורמות14, מה שגורם לחוקרים רבים להשתמש בחבילות תוכנה מרובות כדי למקד ולאמת תוצאות. במאמר זה, אנו מדגישים את השימוש של cryoSPARC v3, RELION-3, ו Scipion 3 כדי לקבל שחזור 3D ברזולוציה גבוהה של AAV, וקטור נפוץ לטיפול גנטי15. חבילות התוכנה הנ”ל הן בחינם למשתמשים אקדמיים; cryoSPARC v3 ו Scipion 3 דורשים רישיונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים זרימת עבודה חזקה של SPA לעיבוד נתונים Cryo-EM בפלטפורמות תוכנה שונות כדי להשיג שחזורי תלת-ממד ברזולוציה גבוהה (איור 1). זרימת עבודה זו חלה על מגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות. השלבים הבאים של הפרוטוקול מפורטים באיור 4, כולל טרום עיבוד סרט, ק…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקרלוס אוסקר סורזאנו על העזרה בהתקנת Scipion3 וקיליאן שנלה וארנה מולר על העזרה בהעברת נתונים בין פלטפורמות עיבוד שונות. חלק ממחקר זה נתמך על ידי מענק NIH U24GM129547 ובוצע ב- PNCC ב- OHSU ונגיש באמצעות EMSL (רשת.436923.9), משרד DOE של מתקן משתמש מדע בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי. מחקר זה נתמך על ידי מענק סטארט-אפ מאוניברסיטת ראטגרס לארק קולצ’יק.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
Referências
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
- PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021)
- Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
- Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020)
- Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- . Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019)
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- . MotionCor2 User Manual Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018)
- Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
- . UCSF PyEM v0.5 Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019)
- Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
- Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
- Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
- Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
- Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
- Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).
