Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie
Summary
Een aangepaste postfixatieprocedure verhoogt het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol dat beschrijft hoe het weefsel moet worden behandeld, de beeldvorming moet worden uitgevoerd en stereologische methoden moeten worden gebruikt om onbevooroordeelde en kwantitatieve gegevens te verkrijgen over vezeltypespecifieke subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspieren.
Abstract
Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie kunnen afbeeldingen met hoge resolutie van vaste monsters met individuele spiervezels worden verkregen. Dit maakt kwantificeringen mogelijk van ultrastructurele aspecten zoals volumefracties, oppervlakte-volumeverhoudingen, morfometrie en fysieke contactlocaties van verschillende subcellulaire structuren. In de jaren 1970 werd een protocol voor verbeterde kleuring van glycogeen in cellen ontwikkeld en de weg vrijgemaakt voor een reeks studies over de subcellulaire lokalisatie van glycogeen en glycogeendeeltjesgrootte met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Terwijl de meeste analyses glycogeen interpreteren alsof het homogeen verdeeld is in de spiervezels en slechts een enkele waarde oplevert (bijvoorbeeld een gemiddelde concentratie), heeft transmissie-elektronenmicroscopie aangetoond dat glycogeen wordt opgeslagen als discrete glycogeendeeltjes in verschillende subcellulaire compartimenten. Hier wordt het stapsgewijze protocol beschreven van weefselverzameling tot de kwantitatieve bepaling van de volumefractie en deeltjesdiameter van glycogeen in de verschillende subcellulaire compartimenten van individuele skeletspiervezels. Overwegingen over hoe 1) weefselmonsters te verzamelen en te kleuren, 2) beeldanalyses en gegevensverwerking uit te voeren, 3) de precisie van schattingen te evalueren, 4) onderscheid te maken tussen spiervezeltypen en 5) methodologische valkuilen en beperkingen zijn inbegrepen.
Introduction
Glycogeendeeltjes zijn samengesteld uit vertakte polymeren van glucose en verschillende bijbehorende eiwitten1 en vormen een belangrijke brandstof tijdens hoge metabolische eisen2. Hoewel niet algemeen erkend, vormen glycogeendeeltjes ook een lokale brandstof, waar sommige subcellulaire processen bij voorkeur glycogeen gebruiken ondanks de beschikbaarheid van andere en duurzamere brandstoffen zoals plasmaglucose en vetzuren3,4.
Het belang van het opslaan van glycogeen als een subcellulaire specifieke gelokaliseerde brandstof is besproken in verschillende beoordelingen5,6 voornamelijk gebaseerd op enkele van de vroegste documentaties van de subcellulaire verdeling van glycogeen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)7,8. De eerste studies gebruikten verschillende protocollen om het contrast van glycogeen van histochemische kleuringstechnieken naar negatieve en positieve kleuringen9,10 te verhogen. Een belangrijke methodologische ontwikkeling was het verfijnde postfixatieprotocol met het kaliumferrocyanide-gereduceerde osmium11,12,13,14, dat het contrast van glycogeendeeltjes aanzienlijk verbeterde. Dit verfijnde protocol werd niet gebruikt in een deel van het pionierswerk aan door inspanning geïnduceerde glycogeendepletie15, maar werd opnieuw geïntroduceerd door Graham en collega’s16,17.
Op basis van de 2-dimensionale afbeeldingen wordt de subcellulaire verdeling van glycogeen meestal beschreven als glycogeendeeltjes in drie pools: subsarcolemmaal (net onder het oppervlaktemembraan), intermyofibrillair (tussen de myofibrillen) of intramyofibrillair (binnen de myofibrillen). Glycogeendeeltjes kunnen echter ook worden beschreven als geassocieerd met bijvoorbeeld sarcoplasmatisch reticulum7 of kernen18. Naast de subcellulaire verdeling is het voordeel van het tem-geschatte glycogeengehalte ook dat kwantificering kan worden uitgevoerd op het niveau van één vezel. Dit maakt onderzoek van vezel-naar-vezel variabiliteit en correlatieve analyses met vezeltypen en cellulaire componenten als mitochondriën en lipidedruppels mogelijk.
Hier wordt het protocol beschreven voor het TEM-geschatte vezeltypespecifieke volumetrische gehalte van de drie gemeenschappelijke subcellulaire pools van glycogeen (subsarcolemmaal, intermyofibrillair en intramyofibrillair) in skeletspiervezels. De methode is toegepast op skeletspieren van mensen19, ratten20 pt muizen21; evenals vogels en vissen22; en cardiomyocyten van ratten23.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritieke stap van de methode is het gebruik van gereduceerd osmium door kaliumferrocyanide tijdens postfixatie. De selectiviteit van dit gemodificeerde fixatief voor glycogeendetectie kan niet volledig worden verklaard door chemie, maar omvat ook experimentele bevindingen die aantonen dat dergelijke deeltjes niet worden gedetecteerd in weefsels waarvan bekend is dat ze vrij zijn van glycogeen of in de extracellulaire ruimte11.
Kritische parameters zijn de precisie va…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Zweeds Olympisch Comité.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
Referências
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H. Cellular mechanisms of muscle fatigue. Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -. P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes – the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. . Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
