النهج الجراحي المجسمة للحقن المجهري لجذع الدماغ الذيلي والحبل الشوكي العنقي العلوي عبر Cisterna Magna في الفئران
Summary
عادة ما تنطوي الجراحة المجسمة لاستهداف مواقع الدماغ في الفئران على الوصول من خلال عظام الجمجمة وتسترشد بمعالم الجمجمة. هنا نحدد نهجا مجسما بديلا لاستهداف جذع الدماغ الذيلي والحبل الشوكي العنقي العلوي عبر الصهريج الكبير الذي يعتمد على التصور المباشر لمعالم جذع الدماغ.
Abstract
عادة ما تسترشد الجراحة المجسمة لاستهداف مواقع الدماغ لدى الفئران بمعالم الجمجمة. ثم يتم الحصول على الوصول عن طريق ثقوب لدغ حفر من خلال الجمجمة. يمكن أن يكون هذا النهج القياسي تحديا للأهداف في جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي بسبب التحديات التشريحية المحددة لأن هذه المواقع بعيدة عن معالم الجمجمة ، مما يؤدي إلى عدم الدقة. هنا نوجز نهجا مجسما بديلا عبر cisterna magna الذي تم استخدامه لاستهداف المناطق المنفصلة ذات الأهمية في جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي. يمتد الصهريج الضخم من العظم القذالي إلى الأطلس (أي العظم الفقري الثاني) ، ويمتلئ بالسائل الدماغي الشوكي ، وتغطيه الأم الجافية. يوفر هذا النهج طريقا قابلا للتكرار للوصول إلى هياكل مختارة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) يصعب الوصول إليها بسبب الحواجز التشريحية. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالتصور المباشر لمعالم جذع الدماغ على مقربة من المواقع المستهدفة ، مما يزيد من الدقة عند توصيل كميات حقن صغيرة إلى المناطق المقيدة ذات الأهمية في جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي العلوي. أخيرا ، يوفر هذا النهج فرصة لتجنب المخيخ ، والذي يمكن أن يكون مهما للدراسات الحركية والحسية الحركية.
Introduction
عادة ما تتضمن الجراحة المجسمة القياسية لاستهداف مواقع الدماغ في الفئران1 تثبيت الجمجمة باستخدام مجموعة من قضبان الأذن وشريط الفم. ثم يتم تقدير الإحداثيات بناء على الأطالس المرجعية 2,3 ، ومعالم الجمجمة ، وهي bregma (النقطة التي تلتقي فيها خيوط العظام الأمامية والجدارية) أو lambda (النقطة التي تلتقي فيها خيوط العظام الجدارية والقذالية. الشكل 1 ألف، باء). من خلال ثقب لدغ في الجمجمة فوق الهدف المقدر ، يمكن بعد ذلك الوصول إلى المنطقة المستهدفة ، إما لتوصيل الحقن المجهرية أو الأجهزة باستخدام القنية أو الألياف البصرية. بسبب الاختلاف في تشريح هذه الغرز والأخطاء في توطين bregma أو lambda 4,5 ، يختلف موضع نقاط الصفر فيما يتعلق بالدماغ من إلى آخر. في حين أن الأخطاء الصغيرة في الاستهداف، التي تنتج عن هذا التباين، ليست مشكلة بالنسبة للأهداف الكبيرة أو القريبة، فإن تأثيرها أكبر بالنسبة للمناطق الأصغر ذات الأهمية البعيدة عن نقاط الصفر في المستويات الأمامية الخلفية أو الظهرية البطنية و / أو عند دراسة الحيوانات ذات الأحجام المتفاوتة بسبب العمر و / أو الإجهاد و / أو الجنس. هناك العديد من التحديات الإضافية الفريدة من نوعها للنخاع المستطيل والحبل العنقي العلوي. أولا ، ترتبط التغيرات الصغيرة في الإحداثيات الأمامية الخلفية بتغيرات كبيرة في الإحداثيات الظهرية البطنية بالنسبة إلى الجافية ، بسبب موقع وشكل المخيخ (الشكل 1Bi)2،6،7. ثانيا ، لا يوجد الحبل العنقي العلوي داخل الجمجمة2. ثالثا ، يجعل الوضع المائل للعظم القذالي والطبقة العلوية من عضلات الرقبة2 النهج المجسمة القياسي أكثر تحديا للهياكل الموجودة بالقرب من الانتقال بين جذع الدماغ والحبل الشوكي (الشكل 1Bi). أخيرا ، العديد من الأهداف ذات الأهمية في جذع الدماغ الذيلي والحبل العنقي صغيرة2 ، تتطلب حقن دقيقة وقابلة للتكرار 8,9.
نهج بديل من خلال cisterna magna يتحايل على هذه المشاكل. الصهريج الضخم هو مساحة كبيرة تمتد من العظم القذالي إلى الأطلس (الشكل 1 أ، أي العظم الفقري الثاني)10. وهي مليئة بالسائل الدماغي الشوكي وتغطيها الأم الجافية10. تفتح هذه المسافة بين العظم القذالي والأطلس عند ثني الرأس. يمكن الوصول إليه عن طريق التنقل بين البطون المقترنة المتراكبة لعضلة الرأس الطويلة ، مما يعرض السطح الظهري لجذع الدماغ الذيلي. ويمكن بعد ذلك استهداف المناطق ذات الأهمية استنادا إلى معالم هذه المناطق نفسها إذا كانت تقع بالقرب من السطح الظهري؛ أو باستخدام obex ، النقطة التي تفتح فيها القناة المركزية في البطين الرابع ، كنقطة صفر للإحداثيات للوصول إلى هياكل أعمق. تم استخدام هذا النهج بنجاح في مجموعة متنوعة من الأنواع ، بما في ذلك الفئران11 ، القط12 ، الفأر 8,9 ، والرئيسيات غير البشرية13 لاستهداف المجموعة التنفسية البطنية ، أو التكوين الشبكي الإنسي النخاعي ، أو نواة الجهاز الانفرادي ، أو منطقة ما بعد الريما ، أو النواة تحت اللسان. ومع ذلك ، لا يستخدم هذا النهج على نطاق واسع لأنه يتطلب معرفة علم التشريح ، ومجموعة أدوات متخصصة ، ومهارات جراحية أكثر تقدما مقارنة بالنهج التجسيمي القياسي.
هنا نصف نهجا جراحيا خطوة بخطوة للوصول إلى جذع الدماغ والحبل العنقي العلوي عبر الجذع العظمي ، وتصور المعالم ، وتعيين نقطة الصفر (الشكل 2) ، وتقدير وتحسين الإحداثيات المستهدفة للتوصيل المجسمي للحقن المجهري في مناطق جذع الدماغ والحبل الشوكي المنفصلة ذات الأهمية (الشكل 3). ثم نناقش المزايا والعيوب المتعلقة بهذا النهج.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتمد الجراحة المجسمة القياسية عادة على معالم الجمجمة لحساب إحداثيات المواقع المستهدفة في الجهاز العصبي المركزي1. ثم يتم الوصول إلى المواقع المستهدفة عبر ثقوب لدغ التي يتم حفرها من خلال الجمجمة1. هذه الطريقة ليست مثالية لجذع الدماغ الذيلي حيث تقع المواقع ال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل R01 NS079623 و P01 HL149630 و P01 HL095491.
Materials
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
Referências
- JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. . A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004)
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
