تسجيل انتقالات الكالسيوم في الوصلة العصبية العضلية للفأر بدقة زمنية عالية باستخدام المجهر البؤري

تعد مشكلة قياس موجات الكالسيوم السريعة في الخلايا القابلة للإثارة واحدة من أهم الجوانب وأكثرها تحديا لدراسة انتقال الإشارة في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. تلعب أيونات الكالسيوم دورا مهما في تحفيز إطلاق الناقل العصبي ، واللدونة المشبكية ، وتعديل نشاط البروتينات المختلفة داخل الخلايا¹،²،^3،4،5. دراسة إشارات الكالسيوم مهمة أيضا لإيجاد طرق لعلاج الأمراض العصبية التنكسية⁶. لقياس التغيرات في مستويات الكالسيوم ، يشيع استخدام الأصباغ الحساسة للكالسيوم الفلورسنت ، ويتم تحليل التغيرات في مستوى التألق⁷،^8،9.

يمكن تحقيق تحميل أصباغ الكالسيوم في الخلايا بطرق مختلفة. في الغالب ، يتم استخدام الأصباغ الخلوية^10,11. ومع ذلك ، في مثل هذه الحالة ، ليس من الصعب فقط التحكم في تركيز الصبغة داخل الخلية ، ولكن من الصعب أيضا تحديد الخلايا المستهدفة للتحميل. هذه الطريقة غير قابلة للتطبيق لدراسة النهايات العصبية الطرفية لأن الصبغة تدخل الخلايا ما بعد المشبكي. بدلا من ذلك ، تكون الأصباغ الخلوية غير المقصودة أكثر ملاءمة لمثل هذه المستحضرات. في هذه الحالة ، يتم تسليم الأصباغ إلى الخلايا عن طريق الحقن المجهري أو من خلال ماصة التصحيح¹²،^13،14. هناك أيضا طريقة للتحميل من خلال جذع الأعصاب. الطريقة الأخيرة هي الأنسب لمستحضرات الوصلة العصبية العضلية¹⁵،16،¹⁷،¹⁸،^19،20. يسمح بإجراء تلطيخ للخلايا ذات الاهتمام فقط. على الرغم من أن هذه الطريقة لا توفر تقييما دقيقا لتركيز الصبغة في الخلية المستهدفة ، إلا أنه يمكن تقدير التركيز تقريبا من خلال مقارنة مستوى تألق الخلايا في حالة السكون في المحاليل ذات التركيز المعروف للكالسيوم²¹. في هذه الدراسة ، يتم تقديم تعديل لهذه الطريقة المطبقة على نقاط الاشتباك العصبي للثدييات.

دخول الكالسيوم خلال مرحلة إزالة الاستقطاب من إمكانات العمل هو عملية سريعة ، وخاصة في التقاطع العصبي العضلي. لذلك ، لتسجيلها ، هناك حاجة إلى المعدات المناسبة¹. أظهرت دراسة حديثة باستخدام صبغة فلورسنت حساسة للجهد أن مدة جهد العمل في المشبك المحيطي للفأر تبلغ حوالي 300 ميكروثانية²². الكالسيوم العابر ، الذي يتم تقييمه باستخدام أصباغ حساسة للكالسيوم في نقاط الاشتباك العصبي الطرفية للضفدع ، له مدة أطول: وقت الارتفاع حوالي 2-6 مللي ثانية ووقت الاضمحلال حوالي 30-90 مللي ثانية ، اعتمادا على صبغة الكالسيوم المستخدمة^23,24. لقياس العمليات السريعة بمساعدة الأصباغ الفلورية ، يتم استخدام كاميرات CCD أو CMOS بشكل عام ، مع مصفوفات CCD سريعة وحساسة. ومع ذلك ، فإن هذه الكاميرات لها عيب الدقة المنخفضة ، محدودة بحجم العناصر الحساسة للمصفوفة²⁵،^26،27،28. أسرع الكاميرات ذات الحساسية الكافية لتسجيل كل من إمكانات الحركة وانتقالات الكالسيوم استجابة للتحفيز منخفض التردد للخلايا لديها تردد مسح ضوئي يبلغ 2000 هرتز ، ومصفوفة ببعد 80 × 80²⁹. للحصول على إشارات ذات دقة مكانية أعلى ، يتم استخدام المجهر البؤري ، خاصة إذا كان من الضروري تقييم بعض التغيرات الحجمية في الإشارة 30،^31،32. ولكن يجب أن نضع في اعتبارنا أن المجهر البؤري لديه سرعة مسح عالية في وضع المسح الضوئي الخطي ، ولكن لا تزال هناك قيود كبيرة على سرعة تسجيلات العمليات السريعة عند بناء صورة مكانية³³. هناك مجاهر متحدة البؤرة تعتمد على أقراص Nipkow الدوارة (المجهر المجهري للمسح الشقي) والماسحات الضوئية متعددة النقاط ، والتي تتمتع بسرعة مسح أعلى. في الوقت نفسه ، فهي أدنى من المجاهر البؤرية الكلاسيكية في تصفية الصور البؤرية (الثقوب المتقاطعة للمجاهر مع قرص Nipkow)32،^34،35. يمكن أن يوفر التصوير البؤري مع المسح الضوئي بالرنين أيضا دقة مكانية وزمنية عالية مطلوبة للقياسات الزمنية العالية³⁶. ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أن تسجيل استجابات الفلورسنت الضعيفة بسرعة مسح عالية عند استخدام الماسحات الضوئية بالرنين يتطلب كاشفات حساسة للغاية مثل أجهزة الكشف الهجينة³⁶.

تقدم هذه المقالة طريقة لزيادة الدقة الزمنية للإشارات المسجلة باستخدام المجهر البؤري للمسح الضوئي بالليزر (LSCM) مع الحفاظ على الدقة المكانية³⁷. الطريقة الحالية هي تطوير إضافي للطرق الموضحة سابقا ونقلها إلى منصة LSCM^38,39,40. لا يتطلب هذا النهج تغييرات في أجهزة المجهر ويستند إلى تطبيق خوارزمية لتسجيل إشارات الفلورسنت المستحثة بشكل دوري مع تحول زمني بالنسبة للحظة التحفيز.