Differentiering av humana pluripotenta stamceller till pankreas beta-cellprekursorer i ett 2D-odlingssystem
Summary
Detta protokoll beskriver en förbättrad metod för att öka samuttrycket av PDX1- och NKX6.1-transkriptionsfaktorer i pankreasförfäder härledda från humana pluripotenta stamceller (hPSC) i plana monolager. Detta uppnås genom att fylla på den färska matrisen, manipulera celldensiteten och dissociera de endodermala cellerna.
Abstract
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) är ett utmärkt verktyg för att studera tidig bukspottkörtelutveckling och undersöka de genetiska bidragsgivarna till diabetes. hPSC-härledda insulinutsöndrande celler kan genereras för cellterapi och sjukdomsmodellering, dock med begränsad effektivitet och funktionella egenskaper. hPSC-härledda pankreasförfäder som är föregångare till betaceller och andra endokrina celler, när de tillsammans uttrycker de två transkriptionsfaktorerna PDX1 och NKX6.1, specificerar förfäderna till funktionella, insulinutsöndrande betaceller både in vitro och in vivo. hPSC-härledda pankreasprogenitorer används för närvarande för cellterapi hos typ 1-diabetespatienter som en del av kliniska prövningar. Nuvarande procedurer genererar emellertid inte en hög andel NKX6.1 och pankreasförfäder, vilket leder till samgenerering av icke-funktionella endokrina celler och få glukosresponsiva, insulinutsöndrande celler. Detta arbete utvecklade således ett förbättrat protokoll för att generera hPSC-härledda pankreasförfäder som maximerar samuttrycket av PDX1 och NKX6.1 i ett 2D-monolager. Faktorerna såsom celltäthet, tillgänglighet av färsk matris och dissociation av hPSC-härledda endodermala celler moduleras som förstärkte PDX1- och NKX6.1-nivåerna i de genererade pankreasförfäderna och minimerade engagemanget för alternativ leverlinje. Studien belyser att manipulering av cellens fysiska miljö under in vitro-differentiering kan påverka härstamningsspecifikation och genuttryck. Därför underlättar det nuvarande optimerade protokollet den skalbara genereringen av PDX1- och NKX6.1-samuttryckande förfäder för cellterapi och sjukdomsmodellering.
Introduction
Diabetes är en komplex metabolisk störning som påverkar miljontals människor globalt. Tillskott av insulin anses vara det enda behandlingsalternativet för diabetes. Mer avancerade fall behandlas med betacellsersättningsterapi, uppnådd genom transplantation av antingen hela kadaveriska bukspottkörteln eller holmar 1,2. Flera frågor omger transplantationsterapi, såsom begränsning med vävnadens tillgänglighet och kvalitet, invasivitet av transplantationsprocedurer utöver det kontinuerliga behovet av immunsuppressiva medel. Detta kräver att man upptäcker nya och alternativa alternativ för betacellsersättningsterapi 2,3. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) har nyligen framträtt som ett lovande verktyg för att förstå mänsklig bukspottkörtelbiologi och som en icke-uttömmande och potentiellt en mer personlig källa för transplantationsterapi 4,5,6,7. HPSC, inklusive mänskliga embryonala stamceller (hESC) och humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC), har en hög självförnyelsekapacitet och ger upphov till alla vävnadstyper i människokroppen. hESC härrör från embryots inre cellmassa, och hiPSC omprogrammeras från vilken somatisk cellsom helst 4,8.
Riktade differentieringsprotokoll är optimerade för att generera betaceller i bukspottkörteln från hPSC som sekventiellt leder hPSC genom pankreasutvecklingsstadier invitro. Dessa protokoll genererar hPSC-härledda öorganoider. Medan de har förbättrats avsevärt för att öka andelen beta-celler i bukspottkörteln däri, är protokollens effektivitet mycket varierande. Det ökar inte till mer än ~ 40% av NKX6.1 + / INSULIN + eller C-PEPTIDE + celler 5,9,10,11,12,13. De genererade betacellerna är emellertid inte helt identiska med de vuxna humana betacellerna när det gäller deras transkriptionella och metaboliska profiler och deras svar på glukos 4,5,14. De hPSC-härledda betacellerna saknar genuttryck av viktiga betacellmarkörer som PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 och KCNK3 jämfört med vuxna människor öar5. Dessutom har de hPSC-härledda betacellerna minskat kalciumsignalering som svar på glukos. De är förorenade med de samgenererade polyhormonella cellerna som inte utsöndrar lämpliga mängder insulin som svar på ökande glukosnivåer5. Å andra sidan skulle hPSC-härledda pankreasförfäder, som är öprekursorer, kunna genereras mer effektivt in vitro jämfört med betaceller och, när de transplanteras in vivo, mogna till funktionella, insulinutsöndrande betaceller15,16. Kliniska prövningar är för närvarande inriktade på att visa deras säkerhet och effekt vid transplantation hos T1D-försökspersoner.
I synnerhet är uttryck av transkriptionsfaktorerna PDX1 (Pankreas och Duodenal Homeobox 1) och NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) inom samma pankreasstamcell avgörande för engagemang mot en betacellslinje5. Bukspottkörtelprogenitorer som inte uttrycker NKX6.1 ger upphov till polyhormonella endokrina celler eller icke-funktionella betaceller17,18. Därför är ett högt samuttryck av PDX1 och NKX6.1 i bukspottkörtelns stamfaderstadium avgörande för att i slutändan generera ett stort antal funktionella betaceller. Studier har visat att en embryoidkropp eller 3D-odling förbättrar PDX1 och NKX6.1 hos pankreasförfäder där de differentierande cellerna aggregeras och varierar mellan 40% -80% av PDX1 + / NKX6.1+ -populationen12,19. Men jämfört med suspensionskulturer är 2D-differentieringskulturer mer kostnadseffektiva, genomförbara och praktiska för applicering på flera cellinjer5. Vi visade nyligen att monolagerdifferentieringskulturer ger mer än upp till 90% av PDX1+/NKX6.1+ samuttryckande hPSC-härledda pankreasförfäder20,21,22. Den rapporterade metoden gav en hög replikeringskapacitet till de genererade pankreasprogenitorerna och förhindrade alternativa ödesspecifikationer såsom leverlinje21. Därför visar detta protokoll här en mycket effektiv metod för differentiering av hPSC till pankreas beta-cellprekursorer som samuttrycker PDX1 och NKX6.1. Denna metod använder tekniken för att dissociera hPSC-härledd endoderm och manipulera celltätheten, följt av en utökad FGF- och Retinoid-signalering samt Hedgehog-hämning för att främja PDX1 och NKX6.1 samuttryck (Figur 1). Denna metod kan underlätta en skalbar generering av hPSC-härledda betacellprekursorer i bukspottkörteln för transplantationsterapi och sjukdomsmodellering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete beskriver ett förbättrat protokoll för att generera pankreasprogenitorer från hPSCs med ett högt samuttryck av PDX1 och NKX6.1. Dissociation och replating av hPSC-härledd endoderm vid halv densitet på färsk matris resulterade i högre PDX1 och NKX6.1 hos hPSC-härledda pankreasförfäder.
Även om tillväxtfaktorcocktailen för varje steg är mycket lik P1-ND 27, har det visat sig att en mer utökad steg 3-behandling inklusive FGF- och retinoidsignalering och BMP- och igel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av ett bidrag från Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
Referências
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
