Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

O diabetes é um distúrbio metabólico complexo que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. A suplementação de insulina é considerada a única opção de tratamento para diabetes. Casos mais avançados são tratados com terapia de reposição de células beta, obtida por meio de transplante de pâncreas cadavérico inteiro ou ilhotas ^1,2. Diversas questões envolvem a terapia de transplante, como a limitação com a disponibilidade e qualidade do tecido, a invasividade dos procedimentos de transplante, além da necessidade contínua de imunossupressores. Isso requer a necessidade de descobrir opções novas e alternativas para a terapia de reposição de células beta ^2,3. As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) emergiram recentemente como uma ferramenta promissora para a compreensão da biologia do pâncreas humano e como uma fonte não exaustiva e potencialmente mais personalizada para a terapia de transplante 4,5,6,7. As hPSCs, incluindo as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células estaminais pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), têm uma elevada capacidade de auto-renovação e dão origem a qualquer tipo de tecido do corpo humano. As hESCs são derivadas da massa celular interna do embrião e as hiPSCs são reprogramadas a partir de qualquer célula somática ^4,8.

Os protocolos de diferenciação dirigida são otimizados para gerar células beta pancreáticas a partir de hPSCs que direcionam sequencialmente as hPSCs através dos estágios de desenvolvimento pancreático invitro. Esses protocolos geram organoides de ilhotas derivados de hPSC. Embora tenham melhorado muito no aumento da proporção de células beta pancreáticas, a eficiência dos protocolos é altamente variável. Não aumenta para mais de ~40% das células NKX6.1+/INSULIN+ ou C-PEPTIDE+ 5,9,10,11,12,13. No entanto, as células beta geradas não são inteiramente idênticas às células beta humanas adultas em termos de seus perfis transcricionais e metabólicos e sua resposta à glicose ^4,5,14. As células beta derivadas de hPSC não têm expressão gênica de marcadores de células beta chave, como PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 e KCNK3 em comparação com ilhotas humanas adultas⁵. Além disso, as células beta derivadas de hPSC diminuíram a sinalização de cálcio em resposta à glicose. Eles estão contaminados com as células poli-hormonais cogeradas que não secretam quantidades adequadas de insulina em resposta ao aumento dos níveis de glicose⁵. Por outro lado, os progenitores pancreáticos derivados de hPSC, que são precursores de ilhotas, poderiam ser gerados de forma mais eficiente in vitro em comparação com as células beta e, quando transplantados in vivo, poderiam amadurecer em células beta funcionais e secretoras de insulina^15,16. Os ensaios clínicos estão atualmente focados em demonstrar sua segurança e eficácia após o transplante em indivíduos com DM1.

Notavelmente, a expressão dos fatores de transcrição PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) e NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) dentro da mesma célula progenitora pancreática é crucial para o comprometimento com uma linhagem de células beta⁵. Progenitores pancreáticos que não expressam NKX6.1 dão origem a células endócrinas poli-hormonais ou células beta não funcionais^17,18. Portanto, uma alta co-expressão de PDX1 e NKX6.1 no estágio progenitor pancreático é essencial para gerar um grande número de células beta funcionais. Estudos têm demonstrado que um corpo embrionário ou cultura 3D aumenta PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos onde as células diferenciadoras são agregadas, variando entre 40%-80% da população PDX1+/NKX6.1+^12,19. No entanto, em comparação com as culturas de suspensão, as culturas de diferenciação 2D são mais econômicas, viáveis e convenientes para aplicação em múltiplas linhagens celulares⁵. Recentemente, mostramos que as culturas de diferenciação de monocamadas produzem mais de até 90% de progenitores pancreáticos derivados de hPSC coexpressivos PDX1+/NKX6.1+^20,21,22. O método relatado conferiu alta capacidade de replicação aos progenitores pancreáticos gerados e evitou especificações de destino alternativo, como a linhagem hepática²¹. Portanto, neste documento, este protocolo demonstra um método altamente eficiente para a diferenciação de hPSCs para precursores de células beta pancreáticas co-expressando PDX1 e NKX6.1. Este método utiliza a técnica de dissociação da endoderme derivada da hPSC e manipulação da densidade celular, seguida de uma sinalização estendida de FGF e Retinóide, bem como inibição de Hedgehog para promover a co-expressão de PDX1 e NKX6.1 (Figura 1). Este método pode facilitar uma geração escalável de precursores de células beta pancreáticas derivados de hPSC para terapia de transplante e modelagem de doenças.