Differentiering af humane pluripotente stamceller til pancreas betacelleprækursorer i et 2D-kultursystem

Diabetes er en kompleks metabolisk lidelse, der påvirker millioner af mennesker globalt. Tilskud af insulin betragtes som den eneste behandlingsmulighed for diabetes. Mere avancerede tilfælde behandles med betacelleudskiftningsterapi, opnået ved transplantation af enten hele kadaverbugspytkirtlen eller holme ^1,2. Flere spørgsmål omgiver transplantationsterapi, såsom begrænsning med tilgængeligheden og kvaliteten af vævet, invasivitet af transplantationsprocedurer ud over det kontinuerlige behov for immunosuppressive midler. Dette nødvendiggør behovet for at opdage nye og alternative muligheder for betacelleudskiftningsterapi ^2,3. Humane pluripotente stamceller (hPSC’er) er for nylig dukket op som et lovende værktøj til forståelse af humane bugspytkirtelbiologi og som en ikke-udtømmende og potentielt en mere personlig kilde til transplantationsterapi 4,5,6,7. hPSC’er, herunder humane embryonale stamceller (hESC’er) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC’er), har en høj selvfornyelseskapacitet og giver anledning til enhver vævstype i det menneskelige legeme. hESC’er stammer fra embryonets indre cellemasse, og hiPSC’er omprogrammeres fra enhver somatisk celle ^4,8.

Rettede differentieringsprotokoller er optimeret til at generere betaceller i bugspytkirtlen fra hPSC’er, der sekventielt leder hPSC’er gennem udviklingsstadier i bugspytkirtlen invitro. Disse protokoller genererer hPSC-afledte øorganoider. Mens de i høj grad er forbedret til at øge andelen af betaceller i bugspytkirtlen deri, er effektiviteten af protokoller meget variabel. Det øges ikke til mere end ~ 40% af NKX6.1 + / INSULIN + eller C-PEPTID + celler 5,9,10,11,12,13. De genererede betaceller er imidlertid ikke helt identiske med de voksne humane betaceller med hensyn til deres transkriptionelle og metaboliske profiler og deres respons på glucose ^4,5,14. De hPSC-afledte betaceller mangler genekspression af vigtige betacellemarkører som PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 og KCNK3 sammenlignet med voksne mennesker øer⁵. Derudover har de hPSC-afledte betaceller formindsket calciumsignalering som reaktion på glukose. De er forurenet med de co-genererede polyhormonale celler, der ikke udskiller passende mængder insulin som reaktion på stigende glukoseniveauer⁵. På den anden side kunne hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre, som er ø-prækursorer, genereres mere effektivt in vitro sammenlignet med betaceller og, når de transplanteres in vivo, modnes til funktionelle, insulinudskillende betaceller^15,16. Kliniske forsøg er i øjeblikket fokuseret på at demonstrere deres sikkerhed og effektivitet ved transplantation hos T1D-forsøgspersoner.

Især er ekspression af transkriptionsfaktorerne PDX1 (Pancreas og Duodenal Homeobox 1) og NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) inden for den samme pancreas stamcellecelle afgørende for engagement i en betacelleafstamning⁵. Pankreatiske forfædre, der ikke udtrykker NKX6.1, giver anledning til polyhormonelle endokrine celler eller ikke-funktionelle betaceller^17,18. Derfor er en høj co-ekspression af PDX1 og NKX6.1 i bugspytkirtlens stamfaderstadium afgørende for i sidste ende at generere et stort antal funktionelle betaceller. Undersøgelser har vist, at en embryoid krop eller 3D-kultur forbedrer PDX1 og NKX6.1 i bugspytkirtelforfædre, hvor de differentierende celler aggregeres, varierende mellem 40% -80% af PDX1 + / NKX6.1 + population^12,19. Sammenlignet med suspensionskulturer er 2D-differentieringskulturer imidlertid mere omkostningseffektive, gennemførlige og praktiske til anvendelse på flere cellelinjer⁵. Vi viste for nylig, at monolagsdifferentieringskulturer giver mere end op til 90% af PDX1+/NKX6.1+ co-ekspressive hPSC-afledte pancreasforfædre^20,21,22. Den rapporterede metode gav en høj replikationskapacitet til de genererede bugspytkirtelforfædre og forhindrede alternative skæbnespecifikationer såsom leverafstamning²¹. Derfor demonstrerer denne protokol heri en yderst effektiv metode til differentiering af hPSC’er til beta-celleprækursorer i bugspytkirtlen, der co-udtrykker PDX1 og NKX6.1. Denne metode anvender teknikken til dissociering af hPSC-afledt endoderm og manipulation af celletætheden efterfulgt af en udvidet FGF- og retinoidsignalering samt pindsvinehæmning for at fremme PDX1 og NKX6.1 co-ekspression (figur 1). Denne metode kan lette en skalerbar generation af hPSC-afledte beta-celleprækursorer i bugspytkirtlen til transplantationsterapi og sygdomsmodellering.