배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화
Summary
배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경줄기세포를 재활성화시키는 방법이 확립되었다. 이 방법을 사용하여, 전신 신호의 역할은 신경 줄기 세포 정지, 출입의 조절에서 조직 내재적 신호로부터 결합되지 않을 수 있다.
Abstract
신경 줄기 세포 (NSCs)는 증식, 분화, 아폽토시스를 겪고, 심지어 정지를 출입 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이러한 과정의 대부분은 NSC 내재적 유전 프로그램과 NSC 외인성 인자, 국소 및 전신 간의 복잡한 상호 작용에 의해 제어됩니다. 유전 모델 유기체에서, Drosophila melanogaster, NSCs, 신경 세포 (NBs)로 알려진, 정지에서 증식 동안 배아에서 애벌레로 전환. 이 기간 동안 애벌레는 달걀 껍질에서 나와서식이 영양소를 찾아 기어 다니기 시작합니다. 동물 먹이에 대한 반응으로, 지질 저장 능력을 가진 내분비 기관 인 지방 몸체는 순환하는 용혈림프로 전신적으로 방출되는 신호를 생성합니다. 지방 신체 유래 신호 (FBDS)에 반응하여 초파리 인슐린 유사 펩티드 (Dilps)가 생성되어 뇌 신경 분비 뉴런 및 글리아교에서 방출되어 NB와 그 아교 및 기관 틈새 시장에서 PI3-키나제 성장 신호 전달의 하류 활성화로 이어집니다. 이것이 NB가 정지에서 확산으로 전환하는 방법에 대한 현재 모델이지만, FBDS 외인성 큐의 본질은 여전히 애매합니다. NB 외인성 전신 단서가 정지로부터의 출구를 조절하는 방법을 더 잘 이해하기 위해, 동물 먹이를 먹기 전에 시험관 내에서 초기 애벌레 뇌를 배양하는 방법이 개발되었습니다. 이 방법을 이용하면, 외인성 인자가 배양 배지에 공급될 수 있고 NB는 정지 분석으로부터 빠져나갈 수 있다. 우리는 외인성 인슐린이 전뇌 외식식물에서 정지로부터 NB를 재활성화시키기에 충분하다는 것을 발견했습니다. 이 방법은 대규모 스크린에 매우 적합하기 때문에 NB 정지 대 증식 결정을 조절하는 추가적인 외인성 단서를 식별하는 것을 목표로합니다. NSC 증식 결정을 조절하는 유전자와 경로가 진화적으로 보존되기 때문에, 이 분석의 결과는 클리닉에서 재생 요법을 개선하는 데 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
Introduction
줄기 세포는 재생 의학 1,2에 사용할 수있는 잠재력 때문에 큰 관심이 있습니다. 많은 동물, 특히 오래 사는 동물은 성인 조직 내에서 줄기 세포를 유지합니다. 이러한 상주 줄기 세포는 조직 항상성을 유지하는 기능을 하며 신체적 상해 또는 질병 3,4 이후의 복구에 활용된다. 성체 동물에서 대부분의 줄기 세포는 정지, 성장 신호 전달의 세포 주기 정지 및 불활성화를 특징으로 하는 비교적 휴면 상태이다 5. 외인성 단서에 반응하여 줄기 세포는 정지에서 빠져 나와 세포주기에 들어가 조직 유형에 특유한 딸 자손을 생성하기 시작합니다. 예를 들어, 효과적인 면역 반응을 탑재하기 위해, 항원-제시 세포는 정지된 나이브 T 세포가 세포 주기로 진입하도록 유도하고 clonally 확장6. 골격근 손상에 반응하여, 근육 위성 줄기 세포는 세포주기에 들어가 손상된 myofibrils 5,7을 대체하기 위해 딸 근아세포를 생성합니다. 정지 줄기 세포가 외인성 신호에 반응한다는 것은 분명하지만, 많은 경우 외인성 단서의 본질은 큐 유도 줄기 세포 활성화의 메커니즘뿐만 아니라 불분명하다. 정지 된 줄기 세포가 외인성 단서에 어떻게 반응하고 세포주기에 진입하는지에 대한 더 나은 이해를 얻는 것은 클리닉에서 더 나은 줄기 세포 치료법의 개발에 도움이되고 과학적 지식을 증가시킬 것입니다.
수십 년 동안 모델 유기체는 발달 및 성인기에 줄기 세포 증식을 조절하는 유전자 및 세포 신호 전달 경로를 밝히는 데 사용되어 왔습니다. 초파리에서 신경 줄기 세포 (NBs)로 알려진 신경 줄기 세포 (NSCs)는 발달 전반에 걸쳐 분열하여 궁극적으로 통합되는 모든 뉴런과 글리아교를 생성하여 뇌 기능에 필요한 신경 회로를 형성합니다 8,9. 다른 줄기 세포와 마찬가지로, NB는 비대칭적으로 분열하여 자기 갱신하고, 어떤 경우에는 대칭적으로 줄기 세포 풀을 확장합니다. NB는 배아 발생 중에 지정되며 대부분은 모성 영양소 저장소의 감소와 함께 끝까지 정지에 들어갑니다 (그림 1). 배아 발생이 완료되면 애벌레가 부화하여 먹이를 먹기 시작합니다. 동물 먹이에 대한 응답으로, NBs는 정지로부터 재활성화되고 세포 분열을 재개한다 10,11,12,13,14,15,16. 초파리 CNS는 비교적 간단하고 NB가 정해진 시간에 정해지기 때문에 초파리를 사용하여 정지, 출입 조절을 조사하는 것이 이상적임이 입증됩니다.
그림 1: 발달 시간 동안 CB NB(중추 뇌 신경아세포, 적색) 및 MB NB(버섯체 신경아세포, 파란색)의 상대적 증식. 배아 발생이 끝나면 대부분의 NB (빨간색 선)는 증식을 멈추고 정지에 들어갑니다. 갓 부화 한 애벌레가 첫 번째 완전한 식사를 섭취 할 때까지 정지가 계속됩니다. 이 방법론의 초점 지점은 빨간색 원 (1, 정지 및 2, 재활성화)으로 표시됩니다. MB NB (파란색)는 발달 기간 동안 지속적으로 분열하는 중추 뇌 NB의 하위 집합입니다 (뇌 반구 당 4 개). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동물 먹이에 대한 응답으로, PI3-키나제 및 TOR 성장 신호전달 경로는 NB와 그들의 신경교 및 기관 틈새10,11,15,16에서 활성화된다. 식이 영양소가 철회되거나 PI3-키나아제 수치가 감소하면 NB가 재활성화되지 않고 아교세포와 기관의 성장도10,11,15,16 감소합니다. 현재의 모델은 NB 재활성화가 지방 체내에 의한 애벌레 성장에 결합되며, 이는 동물 먹이12,17,18에 대한 반응으로 전신 신호를 방출한다고 가정한다. 이 신호는 여전히 애매한 상태로 남아 있으며, 뇌에서 초파리 인슐린 유사 펩티드 (Dilps)의 발현과 방출을 촉진하여 NB에서 PI3-kinase의 하류 활성화와 신경교 및 기관 틈새 시장으로 이어집니다. 전신 단서의 본질을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 배양 된 뇌 외식에서 정동작 NB를 재활성화하는 방법을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 NB의 재활성화는 전체 동물 전신 단서가없는 상태에서 분석 할 수 있습니다. 외인성 인자는 티미딘 유사체, EdU의 혼입에 기초한 배양 배지 및 NB 재활성화 검정에 재공급될 수 있다. 이 방법을 사용하여, 우리는 외인성 인슐린이 뇌 외식식물에서 정동작 NB를 재활성화시키기에 충분하다는 것을 결정했다. 앞으로의 연구는 다시 추가 될 때 뇌 외식에서 NB 정지를 긍정적으로 또는 부정적으로 조절하는 추가 요인을 확인하는 것을 목표로합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
뇌 외식편을 배양하기 위해 여기에 기술된 방법은 대부분의 실험실 환경에서 수행될 수 있다. 필요한 도구와 절차 및 데이터 수집은 간단하고 간단합니다. 이 방법을 이용하면, NB 재활성화 및 증식을 조절하는 세포 신호전달 캐스케이드 및 외인성 인자와 관련된 것들을 포함하는 다양한 가설을 시험할 수 있다. 여기에서, 야생형 OregonR 동물을 사용하여, 우리는 외인성 인슐린이 다른 동물 특이적 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 LSAMP Bridges to Doctorate 프로그램 (CNK)과 NIH / NIGMS (R01-GM120421 및 R35-GM141886)를 인정합니다. 그림 1에 대해 Conor Sipe 박사님께 감사드립니다. 우리는 또한 모든 Siegrist 실험실 회원들에게 지속적인 지원과 멘토링에 감사드립니다. 우리는 특히 Chhavi Sood와 Gary Teeters에게 원고를주의 깊게 읽고 의견을 제공 해 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
Referências
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