सुसंस्कृत ड्रोसोफिला मस्तिष्क में तंत्रिका स्टेम सेल पुनर्सक्रियन स्पष्टीकरण
Summary
सुसंस्कृत ड्रोसोफिला मस्तिष्क स्पष्टीकरण में quiescent तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को फिर से सक्रिय करने के लिए एक विधि स्थापित की गई है। इस विधि का उपयोग करते हुए, प्रणालीगत संकेतों की भूमिका को तंत्रिका स्टेम सेल क्विसेंस, प्रवेश और निकास के विनियमन में ऊतक-आंतरिक संकेतों से जोड़ा जा सकता है।
Abstract
तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) में एपोप्टोसिस को फैलाने, अलग करने, गुजरने और यहां तक कि प्रवेश करने और बाहर निकलने की क्षमता होती है। इनमें से कई प्रक्रियाओं को एनएससी बाहरी कारकों, स्थानीय और प्रणालीगत के साथ एनएससी आंतरिक आनुवंशिक कार्यक्रमों के बीच जटिल इंटरप्ले द्वारा नियंत्रित किया जाता है। आनुवांशिक मॉडल जीव में, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एनएससी, जिसे न्यूरोब्लास्ट्स (एनबीएस) के रूप में जाना जाता है, भ्रूण से लार्वा संक्रमण के दौरान प्रसार के लिए क्विसेंस से स्विच करते हैं। इस समय के दौरान, लार्वा उनके अंडे के छिलके से उभरते हैं और आहार पोषक तत्वों की तलाश में रेंगना शुरू करते हैं। पशु आहार के जवाब में, वसा शरीर, लिपिड भंडारण क्षमता के साथ एक अंतःस्रावी अंग, एक संकेत का उत्पादन करता है, जिसे परिसंचारी हेमोलिम्फ में व्यवस्थित रूप से जारी किया जाता है। वसा शरीर व्युत्पन्न संकेत (एफबीडीएस) के जवाब में, ड्रोसोफिला इंसुलिन जैसे पेप्टाइड्स (डिल्प्स) का उत्पादन और मस्तिष्क न्यूरोसेक्रेटरी न्यूरॉन्स और ग्लिया से जारी किया जाता है, जिससे एनबीएस में पीआई 3-किनेज विकास सिग्नलिंग के डाउनस्ट्रीम सक्रियण और उनके ग्लियाल और श्वासनली आला। यद्यपि यह वर्तमान मॉडल है कि कैसे एनबीए क्विसेंस से प्रसार के लिए स्विच करते हैं, एफबीडीएस बाहरी क्यू की प्रकृति मायावी बनी हुई है। बेहतर ढंग से समझने के लिए कि एनबी बाह्य प्रणालीगत संकेत क्विसेंस से बाहर निकलने को कैसे विनियमित करते हैं, पशु आहार से पहले विट्रो में शुरुआती लार्वा दिमाग को संस्कृति करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी। इस विधि के साथ, बहिर्जात कारकों को संस्कृति मीडिया और एनबी को आपूर्ति की जा सकती है जो कि परीक्षित से बाहर निकलते हैं। हमने पाया कि बहिर्जात इंसुलिन पूरे मस्तिष्क स्पष्टीकरण में क्विसेंस से एनबीए को फिर से सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है। क्योंकि यह विधि बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, इसलिए हम अतिरिक्त बाहरी संकेतों की पहचान करने का लक्ष्य रखते हैं जो एनबी क्विसेंस बनाम प्रसार निर्णयों को विनियमित करते हैं। क्योंकि जीन और मार्ग जो एनएससी प्रसार निर्णयों को विनियमित करते हैं, वे विकासवादी रूप से संरक्षित होते हैं, इस परख के परिणाम क्लिनिक में पुनर्योजी उपचारों में सुधार करने में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
पुनर्योजी चिकित्सा 1,2 में उपयोग के लिए उनकी क्षमता के कारण स्टेम कोशिकाएं बहुत रुचि रखती हैं। कई जानवर, विशेष रूप से वे जो लंबे समय तक रहते हैं, अपने वयस्क ऊतकों के भीतर स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखते हैं। ये निवासी स्टेम कोशिकाएं ऊतक होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए कार्य करती हैं और शारीरिक चोट या बीमारी 3,4 के बाद मरम्मत के लिए उपयोग की जाती हैं। वयस्क जानवरों में अधिकांश स्टेम कोशिकाएं क्विसेंट होती हैं, जो एक अपेक्षाकृत निष्क्रिय अवस्था होती है जो सेल चक्र गिरफ्तारी और विकास सिग्नलिंग 5 की निष्क्रियता की विशेषता होतीहै। बाहरी संकेतों के जवाब में, स्टेम कोशिकाएं क्विसेंस से बाहर निकलती हैं, सेल चक्र में प्रवेश करती हैं और अपने ऊतक प्रकार के लिए विशिष्ट बेटी संतान पैदा करना शुरू कर देती हैं। उदाहरण के लिए, एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को माउंट करने के लिए, एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं कोशिका चक्र में प्रवेश करने और क्लोनल रूप से 6 का विस्तार करने के लिए क्विसेंट भोले टी कोशिकाओं को प्रेरित करतीहैं। कंकाल की मांसपेशियों की क्षति के जवाब में, मांसपेशियों की उपग्रह स्टेम कोशिकाएं कोशिका चक्र में प्रवेश करती हैं और क्षतिग्रस्त मायोफिब्रिल 5,7 को बदलने के लिए बेटी मायोब्लास्ट उत्पन्न करती हैं। हालांकि यह स्पष्ट है कि क्विसेंट स्टेम कोशिकाएं बाहरी संकेतों का जवाब देती हैं, कई मामलों में, बाहरी क्यू की प्रकृति अस्पष्ट रहती है और साथ ही क्यू-प्रेरित स्टेम सेल सक्रियण का तंत्र भी। क्विसेंट स्टेम कोशिकाएं बाहरी संकेतों का जवाब देने और सेल चक्र में प्रवेश करने की बेहतर समझ प्राप्त करना क्लिनिक में बेहतर स्टेम सेल उपचार के विकास में सहायता करेगा और वैज्ञानिक ज्ञान में वृद्धि करेगा।
अब दशकों से, मॉडल जीवों का उपयोग जीन और सेल सिग्नलिंग मार्गों को उजागर करने के लिए किया गया है जो विकास के दौरान और वयस्कता में स्टेम सेल प्रसार को विनियमित करते हैं। ड्रोसोफिला में, तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी), जिसे न्यूरोब्लास्ट्स (एनबी) के रूप में जाना जाता है, सभी न्यूरॉन्स और ग्लिया उत्पन्न करने के लिए पूरे विकास में विभाजित होता है जो अंततः एकीकृत होता है, मस्तिष्क समारोह 8,9 के लिए आवश्यक तंत्रिका सर्किटी बनाता है। अन्य स्टेम कोशिकाओं की तरह, एनबीए स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए असममित रूप से विभाजित होते हैं और कुछ मामलों में, स्टेम सेल पूल का विस्तार करने के लिए सममित रूप से विभाजित होते हैं। एनबी को भ्रूणजनन के दौरान निर्दिष्ट किया जाता है और अधिकांश अंत की ओर क्विसेंस दर्ज करते हैं, जो घटते मातृ पोषक तत्वों के भंडार (चित्रा 1) के साथ संयोग है। भ्रूणजनन पूरा होने के बाद, लार्वा हैच और खिलाना शुरू कर देता है। पशु आहार के जवाब में, एनबीए क्विसेंस से फिर से सक्रिय हो जाते हैं और सेल डिवीजनोंको फिर से शुरू करते हैं 10,11,12,13,14,15,16। क्योंकि ड्रोसोफिला सीएनएस अपेक्षाकृत सरल है और क्योंकि एनबीए परिभाषित समय पर क्विसेंस में प्रवेश करते हैं और बाहर निकलते हैं, ड्रोसोफिला का उपयोग करके क्विसेंस, प्रवेश और निकास के विनियमन की जांच करने के लिए, आदर्श साबित होता है।
चित्रा 1: सीबी एनबी (केंद्रीय मस्तिष्क न्यूरोब्लास्ट्स, लाल) और एमबी एनबीए (मशरूम बॉडी न्यूरोब्लास्ट्स, नीले) के सापेक्ष प्रसार विकास के समय पर। Embryogenesis के अंत में, अधिकांश NBs (लाल रेखा) प्रसार बंद कर देते हैं और quiescence में प्रवेश करते हैं। Quiescence तब तक जारी रहता है जब तक कि ताजा हैच किए गए लार्वा अपने पहले पूर्ण भोजन का उपभोग नहीं करते। इस पद्धति के लिए फोकस के समय बिंदुओं को लाल हलकों (1, क्विसेंस और 2, पुनर्सक्रियन) में दर्शाया जाता है। एमबी एनबीए (नीला) केंद्रीय मस्तिष्क एनबीए का एक सबसेट है जो पूरे विकास (4 प्रति मस्तिष्क गोलार्ध) में लगातार विभाजित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पशु आहार के जवाब में, PI3-kinase और TOR विकास सिग्नलिंग मार्ग NBs में और उनके glial और श्वासनली आला10,11,15,16 में सक्रिय हो जाते हैं। जब आहार पोषक तत्वों को वापस ले लिया जाता है या जब पीआई 3-किनेज के स्तर को कम कर दिया जाता है, तो एनबीए पुन: सक्रिय करने में विफल रहते हैं और ग्लिया और श्वासनली की वृद्धि भी10,11,15,16 कम हो जाती है। वर्तमान मॉडल यह मानता है कि एनबी पुनर्सक्रियन को वसा शरीर द्वारा लार्वा विकास के लिए युग्मित किया जाता है, जोपशु आहार 12,17,18 के जवाब में एक प्रणालीगत संकेत जारी करता है। यह संकेत, जो मायावी बना हुआ है, संभवतः मस्तिष्क में ड्रोसोफिला इंसुलिन जैसे पेप्टाइड (डिल्प्स) की अभिव्यक्ति और रिहाई को बढ़ावा देता है, जो एनबीए में पीआई 3-किनेज के डाउनस्ट्रीम सक्रियण और उनके ग्लियाल और श्वासनली आला की ओर जाता है। प्रणालीगत क्यू (ओं) की प्रकृति को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने सुसंस्कृत मस्तिष्क स्पष्टीकरण में क्विसेंट एनबीए को फिर से सक्रिय करने के लिए एक विधि विकसित की। इस विधि के साथ, पूरे पशु प्रणालीगत संकेतों की अनुपस्थिति में NBs के पुनर्सक्रियन को परखा जा सकता है। बहिर्जात कारकों को संस्कृति मीडिया और एनबी पुनर्सक्रियन को फिर से आपूर्ति की जा सकती है, जो थाइमिडिन एनालॉग, ईडीयू के निगमन के आधार पर परखा जाता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने निर्धारित किया कि बहिर्जात इंसुलिन मस्तिष्क स्पष्टीकरण में क्विसेंट एनबीए को फिर से सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है। भविष्य के काम का उद्देश्य अतिरिक्त कारकों की पहचान करना होगा, जब वापस जोड़ा जाता है, तो या तो सकारात्मक या नकारात्मक रूप से मस्तिष्क स्पष्टीकरण में एनबी क्विसेंस को विनियमित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृति मस्तिष्क स्पष्टीकरण के लिए यहां वर्णित विधि को अधिकांश प्रयोगशाला वातावरण में किया जा सकता है। आवश्यक उपकरण, साथ ही साथ प्रक्रिया और डेटा संग्रह, सरल और सरल हैं। इस विधि के साथ, कोई भी विभिन्न …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वित्तपोषण (CNK) के साथ-साथ NIH / NIGMS (R01-GM120421 और R35-GM141886) के लिए डॉक्टरेट कार्यक्रम के लिए LSAMP ब्रिज को स्वीकार करते हैं। हम चित्रा 1 के लिए डॉ कॉनर Sipe के आभारी हैं। हम सभी Siegrist प्रयोगशाला के सदस्यों को उनके निरंतर समर्थन और मेंटरशिप के लिए भी धन्यवाद देते हैं। हम विशेष रूप से पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक पढ़ने और टिप्पणियां प्रदान करने के लिए छवी सूद और गैरी टीटर्स को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
Referências
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
