Анализ дифференцировки клеток, морфогенеза и паттернинга во время эмбриогенеза курицы с использованием анализа промокшей из бусин
Summary
Анализ на вымоченные шарики включает в себя целевую доставку тестового реагента в любой момент развития для изучения регуляции дифференцировки и морфогенеза клеток. Представлен подробный протокол, применимый к любой экспериментальной модели на животных, для приготовления трех различных типов размоченных шариков и их имплантации в интердигит куриного эмбриона.
Abstract
Во время эмбрионального развития активируется множество генетических программ, которые организуют дифференцировку клеток для создания поразительного разнообразия соматических клеток, тканей и органов. Точная активация этих генетических программ регулируется морфогенами, диффузными молекулами, которые направляют судьбу клеток при разных порогах. Понимание того, как генетическая активация координирует морфогенез, требует изучения локальных взаимодействий, вызванных морфогенами во время развития. Использование шариков, пропитанных белками, или лекарств, имплантированных в отдельные области эмбриона, позволяет изучить роль специфических молекул в установлении пальцев и других процессах развития. Этот экспериментальный метод предоставляет информацию о контроле индукции клеток, судьбе клеток и формировании паттернов. Таким образом, этот анализ на вымощенные бусины является чрезвычайно мощным и ценным экспериментальным инструментом, применимым к другим эмбриональным моделям.
Introduction
Прорывы в молекулярных механизмах, которые контролируют экспрессию генов во время эмбрионального развития, позволили нам понять, как определяется судьба клеток. Приверженность различным клеточным линиям происходит, как только клетки начинают молекулярную экспрессию факторов транскрипции1. Этот паттерн экспрессии хорошо скоординирован в пространстве и времени и, таким образом, направляет формирование, позиционирование и паттерн клеток, тканей и органов 1,2,3,4,5. Эмбриональная индукция – это процесс, посредством которого клетки посвящаются определенным линиям путем установления иерархий, которые ограничивают потенциал клеток, которые даже включают в себя генерацию основного плана тела, как это происходит с организатором Spemann 6,7. Бластопорная дорсальная губа индуцирует вторую эмбриональную ось у эмбриона-хозяина 8,9. Сегодня с помощью прививки и других классических экспериментов в сочетании с молекулярными подходами известно, что различные факторы транскрипции и факторы роста функционируют для прямой эмбриональной индукции в органайзере Spemann10. Таким образом, экспериментальная манипуляция является важным инструментом для понимания клеточной дифференцировки, морфогенеза и паттерновых процессов во время эмбриогенеза.
Интересно, что в эмбриональных системах, где трансплантация тканей затруднена или когда индукторы уже хорошо известны, носители используются для доставки молекул (например, белков, химических веществ, токсинов и т. Д.) Для регулирования дифференцировки клеток, морфогенеза и даже паттернов. Одна из таких систем носителей включает имплантацию шариков, пропитанных определенной молекулой, в любой экспериментальный модельный организм в любой момент времени развития для определения эффекта указанного реагента или направления дифференцировки указанной модели. Например, путем имплантации шариков, пропитанных ретиноевой кислотой (РА), в почку конечности куриного крыла, Шерил Тикл и др. (1985) продемонстрировали, что РА индуцирует экспрессию звукового ежа в зоне поляризационной активности (ZPA)11,12. Та же экспериментальная стратегия была использована, чтобы обнаружить, что РА контролирует асимметрию сомитов и гибель клеток в почке конечности во время развития пальцев и в других эмбриональных областях конечностей 13,14,15. Другие факторы, в основном белки (например, факторы роста фибробластов [FGF], трансформирующий фактор роста-бета [TGF-ß]) использовались для индуцирования конечностей в боках ранних эмбрионов и новых пальцев в межпальцевой области, соответственно 16,17,18,19,20,21 . Эти эксперименты свидетельствуют о силе и полезности этого метода для определения стадии приверженности или компетентности тканей или групп клеток, подвергающихся воздействию молекул.
В этом протоколе конечность цыпленка на стадии образования пальцев служила экспериментальной моделью для представления пошаговых способов подготовки и имплантации пропитанных шариков. Тем не менее, этот экспериментальный инструмент не ограничивается этим применением, но может быть использован в любой экспериментальной модели на животных и в любой точке времени in vitro и in vivo для изучения индукции, дифференцировки, гибели клеток и паттерна.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основным преимуществом экспериментального инструмента, подробно описанного в этом протоколе, является возможность контролировать время и место воздействия шариков, пропитанных данной экспериментальной молекулой. Сочетание правильного позиционирования с точным временем развития д…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Генеральным обществом ассоциаций личной академии (DGAPA)-Национальным автономным университетом Мексики [номера грантов IN211117 и IN213314] и Национальным советом по вопросам науки и техники (CONACyT) [грант No 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia], присужденный JC-M. JC M-L получил постдокторскую стипендию от Национального совета науки и техники (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Авторы высоко ценят помощь Lic. Лючия Брито из Института биомедицинских исследований УНАМ в подготовке ссылок на эту рукопись.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
Referências
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113 (2021).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
- Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977 (2019).
- Gurdon, J. B. Embryonic induction–molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
- Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
- Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann’s organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
- Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
- Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Biologia do Desenvolvimento. 109 (1), 82-95 (1985).
- Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
- Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
- Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Biologia do Desenvolvimento. 302 (1), 267-280 (2007).
- Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
- Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, 8 (2015).
- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Biologia do Desenvolvimento. 200 (1), 35-45 (1998).
- Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Biologia do Desenvolvimento. 321 (2), 343-356 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549 (2013).
- Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
- Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Biologia do Desenvolvimento. 257 (2), 292-301 (2003).
