De hier beschreven methoden schetsen een procedure die wordt gebruikt om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in een gedragsrelevant circuit bij ratten op optogenetisch om te keren. Aanhoudende laagfrequente optische stimulatie van thalamo-amygdala synapsen induceert langdurige depressie (LTD). In vivo optogenetisch geïnduceerde LTD bij cocaïne-ervaren ratten resulteerde in de daaropvolgende verzwakking van cue-gemotiveerde drug seeking.
Dit protocol demonstreert de stappen die nodig zijn om optogenetische hulpmiddelen te gebruiken om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in thalamo-amygdala-circuits om te keren om het daaropvolgende cocaïnezoekgedrag bij de rat te verminderen. In ons onderzoek hadden we ontdekt dat wanneer ratten zelf intraveneuze cocaïne toedienen in combinatie met een audiovisuele cue, synapsen gevormd bij inputs van de mediale geniculate kern van de thalamus (MGN) op de belangrijkste neuronen van de laterale amygdala (LA) sterker worden naarmate de cue-cocaïne associatie wordt geleerd. We veronderstelden dat het omkeren van de door cocaïne geïnduceerde plasticiteit bij deze synapsen cue-gemotiveerde cocaïnezoekgedrag zou verminderen. Om dit type neuromodulatie in vivo te bereiken, wilden we synaptische langdurige depressie (LTD) induceren, die de sterkte van MGN-LA-synapsen vermindert. Hiervoor gebruikten we optogenetica, die neuromodulatie van hersencircuits met behulp van licht mogelijk maakt. De exciterende opsine oChiEF werd uitgedrukt op presynaptische MGN-terminals in de LA door een AAV met oChiEF in de MGN te injecteren. Optische vezels werden vervolgens geïmplanteerd in de LA en 473 nm laserlicht werd gedurende 15 minuten gepulseerd met een frequentie van 1 Hz om LTD te induceren en cocaïne-geïnduceerde plasticiteit om te keren. Deze manipulatie produceert een langdurige vermindering van het vermogen van signalen geassocieerd met cocaïne om drugszoekende acties te induceren.
Middelenmisbruik is een zeer ernstig probleem voor de volksgezondheid in de VS en wereldwijd. Ondanks tientallen jaren van intensief onderzoek zijn er zeer weinig effectieve therapeutische opties 1,2. Een grote tegenslag voor de behandeling is het feit dat chronisch drugsgebruik langdurige associatieve herinneringen genereert tussen omgevingssignalen en het medicijn zelf. Herblootstelling aan drugsgerelateerde signalen stimuleert fysiologische en gedragsmatige reacties die aanhoudend drugsgebruik en terugval motiveren3. Een nieuwe therapeutische strategie is om op geheugen gebaseerde behandelingen uit te voeren die gericht zijn op het manipuleren van de circuits die betrokken zijn bij het reguleren van drug-cue-associaties. Onlangs werd waargenomen dat synapsen in de laterale amygdala (LA), met name die welke voortkomen uit de mediale geniculate nucleus (MGN) van de thalamus, worden versterkt door herhaalde cue-geassocieerde cocaïne zelftoediening, en dat deze potentiëring cocaïnezoekgedrag kan ondersteunen 4,5. Daarom werd voorgesteld dat cue-geïnduceerde re-integratie kon worden verzwakt door plasticiteit bij MGN-LA synapsen om te keren.
Het vermogen om de synaptische plasticiteit van een specifiek hersencircuit nauwkeurig te richten, is een grote uitdaging voor het veld geweest. Traditionele farmacologische hulpmiddelen hebben enig succes gehad bij het verminderen van terugvalgedrag, maar worden beperkt door het onvermogen om individuele synapsen te manipuleren. De recente ontwikkeling van in vivo optogenetica heeft echter de tools opgeleverd die nodig zijn om deze beperkingen te overwinnen en neurale paden te beheersen met temporele en ruimtelijke precisie 6,7,8. Door lichtgevoelige opsins in een specifiek hersencircuit tot expressie te brengen, kan laserlicht vervolgens worden gebruikt om het circuit te activeren of te remmen. Frequentieafhankelijke optische stimulatie kan worden gebruikt om specifiek de synaptische plasticiteit van het circuit in een zich gedragend dier te manipuleren.
Dit manuscript schetst de procedure die is gevolgd om het gedragsrelevante MGN-LA-circuit te manipuleren met behulp van in vivo optogenetica. Eerst werd de exciterende opsine oChIEF uitgedrukt in de MGN en werden optische vezels bilateraal geïmplanteerd in de LA. Dieren werden vervolgens getraind om zelf cocaïne toe te dienen op een cue-afhankelijke manier, wat de MGN-LA-route versterkt. Vervolgens werd aanhoudende, laagfrequente stimulatie met 473 nm laserlicht gebruikt om circuitspecifieke LTD te produceren. Het omkeren van de plasticiteit geïnduceerd door cocaïnegebruik genereerde een langdurige vermindering van het vermogen van signalen om acties te activeren die geassocieerd zijn met drugszoekgedrag.
Zoals hierboven beschreven, zijn er verschillende kritieke stappen die belangrijk zijn voor het bereiken van de juiste experimentele resultaten. Het protocol zal waarschijnlijk alleen effectief zijn bij dieren die op de juiste manier cocaïne zelftoediening krijgen, en tot op heden is het alleen getest met behulp van de hierboven beschreven parameters. Het is mogelijk dat de cocaïnedosis, het schema van versterking en cue-parameters kunnen worden gewijzigd met waarschijnlijk weinig effect op gedragsuitkomsten, met uitzo…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen de steun erkennen van USPHS-subsidies K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) en het Pennsylvania Department of Health.
0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
Betadine | Butler Schein | 38250 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
Heparin | Henry Schein | 55737 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Xylazine | Butler Schein | 33198 |