Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats(수생 서식지에서 탄화수소 대사 특성을 가진 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별)
Summary
우리는 수생 서식지에서 탄화수소 분해 박테리아를 분리, 번식 및 특성화하는 과정을 제시합니다. 이 프로토콜은 박테리아 분리, 16S rRNA 방법에 의한 식별 및 탄화수소 분해 가능성 테스트에 대해 설명합니다. 이 기사는 연구자들이 환경 샘플에서 미생물 생물 다양성을 특성화하고 특히 생물학적 정화 가능성이 있는 미생물을 선별하는 데 도움이 될 것입니다.
Abstract
탄화수소 오염 물질은 분해에 강하기 쉬우며 환경에 축적되면 모든 생명체에 유독합니다. 박테리아는 수많은 촉매 효소를 암호화하고 자연적으로 탄화수소를 대사할 수 있습니다. 과학자들은 수생 생태계의 생물 다양성을 활용하여 생분해 및 생물학적 정화 가능성이 있는 박테리아를 분리합니다. 환경으로부터 분리된 이러한 물질은 풍부한 대사 경로와 효소를 제공하며, 이는 산업적 규모에서 분해 과정을 확장하는 데 추가로 활용될 수 있습니다. 이 기사에서는 수생 서식지에서 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별의 일반적인 과정을 간략하게 설명하고 간단한 기술을 사용하여 시험관 내에서 탄화수소를 유일한 탄소원으로 활용하는 능력을 선별합니다. 본 프로토콜은 16S rRNA 분석을 사용하여 다양한 박테리아 종의 분리 및 후속 식별을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 박테리아 분리주의 탄화수소 분해 가능성을 특성화하기 위한 단계를 제시합니다. 이 프로토콜은 생명 공학 응용을 위해 환경 서식지에서 박테리아 종을 분리하려는 연구자에게 유용할 것입니다.
Introduction
탄화수소(HC)는 연료와 화학 응용 분야 모두에서 광범위하게 사용됩니다. 벤젠, 톨루엔, 자일렌과 같은 방향족 탄화수소가 용매로 널리 사용된다1. 에틸렌 및 프로필렌과 같은 알켄은 각각 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 중합체의 합성에서 전구체 역할을 합니다. 다른 탄화수소 인 스티렌의 중합은 폴리스티렌을 형성합니다. 인위적 활동은 탄화수소를 생산 및 운송 중에 환경에 도입합니다. 토양과 물의 탄화수소 오염은 환경과 인간의 건강에 심각한 문제를 안겨줍니다. 미생물은 생지화학적 순환을 조절하고 오염 물질과 생체 이물학을 포함한 광범위한 기질을 활용하여 탄소와 에너지원으로 전환함으로써 생태계를 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 미생물에 의한 환경 오염 물질의 해독 과정은 생물학적 정화 3,4,5,6,7로 알려져 있다.
탄화수소를 분해하는 능력을 가진 미생물은 수생 및 토양 서식지에서 발견된다 8,9,10. 슈도모나스(Pseudomonas), 아시네토박터(Acinetobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 마리노박터(Marinobacter) 및 올레이박터(Oleibacter)와 같이 알칸과 방향족 HC를 분해할 가능성이 있는 많은 박테리아가 확인되었습니다 11. 기술적으로 진보된 배양 독립적 접근법의 개발은 새로운 HC 분해 미생물 군집을 발견하는 데 도움이 되었습니다12. 소스 샘플에서 직접 분리된 게놈 물질은 차세대 염기서열 분석(NGS)과 같은 고처리량 방법으로 증폭 및 시퀀싱된 후 분석되므로 미생물을 배양할 필요가 없습니다. 메타게놈 분석(metagenome analysis)과 같은 NGS 방법은 비용이 많이 들고 증폭 과정과 관련된 단점이 있다13. 탄화수소 분해 미생물의 분리를 목표로 하는 선택적 농축 배양(selective enrichment culture)14과 같은 배양 기술은 연구자들이 박테리아 분리주에서 대사 경로를 조사하고 조작할 수 있게 해주기 때문에 여전히 유용하다.
게놈 DNA 분리 및 게놈 물질의 후속 시퀀싱은 모든 유기체에 대한 귀중한 정보를 보여줍니다. 전체 게놈 시퀀싱은 항생제 내성, 잠재적 약물 표적, 독성 인자, 수송체, 생체 이물 대사 효소 등을 암호화하는 유전자를 식별하는 데 도움이 됩니다15,16,17. 16SrRNA 인코딩 유전자의 시퀀싱은 박테리아 계통발생을 식별하는 강력한 기술임이 입증되었습니다. 수년에 걸쳐 유전자 서열과 기능을 보존하면 알려지지 않은 박테리아를 식별하고 분리된 균주를 가장 가까운 종과 비교하는 신뢰할 수 있는 도구가 됩니다. 또한, 이 유전자의 길이는 생물정보학 분석에 최적이다18. 범용 프라이머를 사용한 유전자 증폭의 용이성 및 유전자 시퀀싱 기술의 개선과 함께 이러한 모든 기능은 미생물 식별을 위한 황금 표준이 되었습니다.
여기에서는 환경 샘플에서 HC 분해 가능성이 있는 배양 가능한 미생물을 회수하는 절차를 설명합니다. 이하에 기술된 방법은 HC-분해성 박테리아의 수집 및 식별을 개략적으로 설명하며, 5개의 섹션으로 나뉩니다: (1) 물 샘플로부터의 박테리아 수집, (2) 순수 배양물의 분리, (3) 박테리아 분리주의 HC-분해 능력 탐색, (4) 게놈 DNA 분리, 및 (5) 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 BLAST 분석에 기초한 식별. 이 절차는 다양한 생명 공학 응용 분야에서 박테리아를 분리하는 데 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 시료 채취, 처리 및 분석 참고: 여기에서는 수생 서식지에서 박테리아를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 분리 물 중 일부는 병원성 일 수 있으므로 장갑을 착용하고 사용 전후에 작업 영역을 소독하십시오. 수역의 다른 위치에서 5개의 멸균 유리병에 500mL의 물 샘플을 수집합니다. pH 측정기와 온도계를 각각 사용하여 각 샘플의 pH와 온도를 측정합니다….
Representative Results
수생 서식지에서 박테리아를 분리 및 스크리닝하고 16S rRNA 분석에 의한 후속 식별을 위한 전체 절차를 요약한 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. 인도 다드리(Dadri)의 습지에서 채취한 물 샘플을 멸균 유리병에 담아 즉시 실험실로 가져가 처리했습니다. 샘플을 0.22 μm 기공 크기의 필터 시트에 통과시키고 여과지를 다른 매체 플레이트와 접촉시켰다. 2시간 후, 여…
Discussion
지구상의 박테리아 중 약 1%만이 실험실에서 쉽게 배양될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다6. 배양 가능한 박테리아 중에서도 많은 사람들이 특성화되지 않은 채로 남아 있습니다. 분자 방법의 개선은 박테리아 군집의 분석 및 평가에 새로운 차원을 부여했습니다. 그러나 이러한 기술에는 한계가 있지만 문화 분석이 중복되지는 않습니다. 개별 박테리아 종을 분리하기 위한 순수 배…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
유용한 의견과 제안을 해주신 Karthik Krishnan 박사와 RP 연구소 구성원들에게 감사드립니다. DS는 SNU-Doctoral Fellowship과 Earthwatch Institute India Fellowship의 지원을 받고 있습니다. RP 연구소는 Shiv Nadar University의 CSIR-EMR 보조금 및 창업 자금으로 지원됩니다.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
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Citar este artigo
Sethi, D., Priyadarshini, R. Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats. J. Vis. Exp. (178), e63101, doi:10.3791/63101 (2021).