Ekstraksjonen av leverglykogenmolekyler for bestemmelse av glykogenstruktur

Glykogen er en kompleks, hyperforgrenet polymer av glukose som finnes i dyr, sopp og bakterier¹. Hos pattedyr fungerer leverglykogen som en blodsukkerbuffer, og bevarer homeostase, mens muskelglykogen fungerer som et kortsiktig glukosereservoar for å gi energi direkte². Strukturen av glykogen er ofte beskrevet av tre nivåer (vist i figur 1): 1. Lineære kjeder dannes av glukosemonomerer via (1→4)-α glykosidbindinger, med grenpunkter forbundet via (1→6)-α glykosidbindinger; 2. høyt forgrenede β partikler (~ 20 nm i diameter) som, spesielt i vev som skjelettmuskulatur, fungerer som uavhengige glykogenmolekyler ^3,4; 3. Større α glykogenpartikler (opptil 300 nm i diameter) som består av mindre β glykogenenheter, som finnes i leveren⁵, hjerte⁶ og i noen ikke-pattedyrarter⁷. Hepatiske α partikler fra diabetiske mus er molekylært skjøre, med en tilbøyelighet til å nedbrytes til β-partikler når de oppløses i dimetylsulfoksid (DMSO), mens α partikler fra ikke-diabetiske kontroller generelt forblir uendret. En hypotese er at denne skjørheten kan forverre den dårlige blodsukkerbalansen man ser ved diabetes, med de skjøre α partiklene som potensielt kan resultere i høyere andeler av den raskere nedbrutte β partikkel 8,9,10,11.

Tradisjonelle glykogenekstraksjonsmetoder benytter de relativt tøffe forholdene for å utsette levervevet for varm alkalisk oppløsning¹² eller syreoppløsninger som trikloreddiksyre (TCA)¹³ eller perklorsyre (PCA)¹⁴. Mens de er effektive til å separere glykogenet fra andre komponenter i levervevet, nedbryter disse metodene uunngåelig glykogenstrukturen til en viss grad^15,16. Selv om disse metodene er egnet for kvantitativ måling av glykogeninnholdet, er de ikke ideelle for studier som fokuserer på å oppnå strukturell informasjon om glykogenet på grunn av denne strukturelle skaden. Siden utviklingen av disse metodene har det blitt utviklet en mildere ekstraksjonsprosedyre som benytter kald Tris-buffer (vist å hemme nedbrytning av glukosidase) med sukrosetetthetsgradient ultrasentrifugering 17,18,19. Med pH kontrollert ved ~ 8, utsetter denne metoden ikke glykogenet for syre eller alkalisk hydrolyse sett i tidligere prosedyrer.

Sukrose tetthetsgradient ultracentrifugering av homogenisert levervev kan skille glykogenpartikler fra flertallet av cellemateriale. Om nødvendig kan ytterligere rensing utføres ved preparativ størrelsesekskluderingskromatografi, noe som resulterer i innsamling av renset glykogen med vedlagte glykogenassosierende proteiner²⁰. Selv om denne metoden, med mildere forhold, er mer sannsynlig å bevare strukturen av glykogen, er det vanskelig å forhindre at en del av glykogenet går tapt i supernatanten, spesielt mindre glykogenpartikler som er mindre tette¹⁵. En annen potensiell årsak til glykogentap er at de mildere forholdene tillater noe enzymatisk nedbrytning, noe som resulterer i lavere glykogenutbytter sammenlignet med strengere ekstraksjonsmetoder. Nylig forskning rapporterte optimalisering av lever-glykogenekstraksjonsmetoden for å bevare strukturen av glykogen²¹. Her ble forskjellige sukrosekonsentrasjoner (30%, 50%, 72,5%) testet for å avgjøre om lavere sukrosekonsentrasjoner minimerte tapet av mindre glykogenpartikler. Begrunnelsen var at den lavere tettheten ville tillate mindre, mindre tette partikler å trenge inn i sukroselaget og aggregere i pelleten med resten av glykogenet.

I denne studien ble ekstraksjonsmetodene med og uten et koketrinn på 10 minutter sammenlignet for å teste om glykogennedbrytningsenzymer kunne denatureres, noe som resulterte i ekstraksjon av mer glykogen som også var fri for delvis nedbrytning. Hele molekylstørrelsesfordelinger og glykogenkjedelengdefordelingene ble brukt til å bestemme strukturen til det ekstraherte glykogenet, tilsvarende en optimalisering av stivelsesekstraksjon publisert tidligere²². Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) med differensiell brytningsindeks (DRI) deteksjon ble brukt for å oppnå størrelsesfordelingene av glykogen, som beskriver den totale molekylvekten som en funksjon av molekylstørrelse. Fluoroforassistert karbohydratelektroforese (FACE) ble brukt til å analysere kjedelengdefordelingene, som beskriver det relative antall glukosidkjeder av hver gitt størrelse (eller polymerisasjonsgrad). Denne artikkelen beskriver metoden for å ekstrahere glykogen fra levervev basert på forrige optimaliseringsstudie²¹. Dataene tyder på at metoden som er best egnet til å bevare glykogenstrukturen er en sukrosekonsentrasjon på 30% med et koketrinn på 10 minutter.