एक्स वीवो मिडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स से लेटरल एंटोरिनल कॉर्टेक्स तक लंबी दूरी के सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और प्लास्टिसिटी की ऑप्टोजेनेटिक पूछताछ
Summary
यहां हम तीव्र कृंतक मस्तिष्क स्लाइस में सिनैप्स-विशिष्ट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन की अनुमति देने के लिए ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं के साथ असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के वायरल ट्रांसडक्शन का वर्णन करने वाला एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
मस्तिष्क में विशिष्ट सिनैप्स के शारीरिक गुणों का अध्ययन करना, और वे प्लास्टिक परिवर्तनों से कैसे गुजरते हैं, आधुनिक तंत्रिका विज्ञान में एक महत्वपूर्ण चुनौती है। पारंपरिक इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीक सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को जगाने के लिए विद्युत उत्तेजना का उपयोग करती है। इस विधि का एक बड़ा दोष इसकी निरर्थक प्रकृति है; उत्तेजक इलेक्ट्रोड के क्षेत्र में सभी अक्षतंतु सक्रिय हो जाएंगे, जिससे किसी विशेष अभिवाही कनेक्शन को प्रभाव देना मुश्किल हो जाएगा। ऑप्टोजेनेटिक-आधारित उत्तेजना के साथ विद्युत उत्तेजना को बदलकर इस मुद्दे को दूर किया जा सकता है। हम इन विट्रो पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स के संयोजन के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह सटीक शारीरिक रूप से परिभाषित सिनैप्टिक कनेक्शन के बेसल सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी दोनों के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और मस्तिष्क में लगभग किसी भी मार्ग पर लागू होता है। यहां, हम कृंतक मस्तिष्क में रुचि के पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र (मेडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स) में सर्जिकल इंजेक्शन के लिए एक वायरल वेक्टर एन्कोडिंग चैनलरोडोप्सिन प्रोटीन की तैयारी और हैंडलिंग का वर्णन करते हैं और डाउनस्ट्रीम लक्ष्य क्षेत्रों (पार्श्व एंटोरिनल कॉर्टेक्स) के तीव्र स्लाइस बनाते हैं। लघु और दीर्घकालिक सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए प्रकाश उत्तेजना द्वारा सिनैप्टिक सक्रियण के साथ पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के संयोजन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया भी प्रस्तुत की गई है। हम उन प्रयोगों के उदाहरणों पर चर्चा करते हैं जो ऑप्टोजेनेटिक्स और क्रे-निर्भर सेल लेबलिंग के संयोजन से मार्ग- और सेल-विशिष्टता प्राप्त करते हैं। अंत में, पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र की हिस्टोलॉजिकल पुष्टि को पोस्ट-सिनैप्टिक सेल के बायोसाइटिन लेबलिंग के साथ वर्णित किया गया है, ताकि सटीक स्थान और सेल प्रकार की और पहचान की जा सके।
Introduction
सिनैप्स के शरीर विज्ञान को समझना और वे प्लास्टिक परिवर्तनों से कैसे गुजरते हैं, यह समझने के लिए मौलिक है कि स्वस्थ मस्तिष्क1 में मस्तिष्क नेटवर्क कैसे कार्य करते हैं, और वे मस्तिष्क विकारों में कैसे खराबी करते हैं। तीव्र एक्स विवो मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ एकल न्यूरॉन्स से सिनैप्स की विद्युत गतिविधि की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। झिल्ली क्षमता और सीधे औषधीय हेरफेर का नियंत्रण रिसेप्टर उपप्रकारों के अलगाव की अनुमति देता है। इन रिकॉर्डिंग को पोस्ट-सिनैप्टिक न्यूरॉन की पहचान करने के लिए उत्तम विशिष्टता के साथ बनाया जा सकता है, जिसमें लैमिनार और उप-क्षेत्रीय स्थिति2, सेलुलर आकृति विज्ञान3, आणविक मार्कर4 की उपस्थिति, इसके अभिवाही अनुमान5, या भले ही यह हाल ही में सक्रियथा।
प्री-सिनैप्टिक इनपुट की विशिष्टता प्राप्त करना, हालांकि, कुछ अधिक चुनौतीपूर्ण है। पारंपरिक विधि ने एक विशेष लैमिना में चलने वाले अक्षतंतु को उत्तेजित करने के लिए उत्तेजना इलेक्ट्रोड का उपयोग किया है। इसका एक उदाहरण हिप्पोकैम्पस में है जहां स्ट्रेटम रेडिएटम में स्थानीय उत्तेजना सिनैप्स को सक्रिय करती है जो सीए 3 से सीए 1 उपक्षेत्र 7 तक प्रोजेक्ट करतीहै। इस उदाहरण में, प्रीसिनेप्टिक विशिष्टता प्राप्त की जाती है क्योंकि सीए 3 इनपुट स्ट्रेटम रेडिएटम के भीतर स्थित एकमात्र उत्तेजक इनपुट का प्रतिनिधित्व करता है जो सीए 1 पिरामिड कोशिकाओं 8 को प्रोजेक्ट करताहै। सीए 3-सीए 1 अक्षतंतु के पारंपरिक विद्युत प्रीसिनेप्टिक सक्रियण के साथ प्राप्त इनपुट विशिष्टता की यह उच्च डिग्री, हालांकि, एक अपवाद है जो गहन अध्ययन में परिलक्षित होता है जो इस सिनैप्स के अधीन है। अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में, कई अभिवाही मार्गों से अक्षतंतु एक ही लैमिना में सह-अस्तित्व में होते हैं, उदाहरण के लिए, नियोकॉर्टेक्स9 की परत 1 में, इस प्रकार पारंपरिक उत्तेजक इलेक्ट्रोड के साथ इनपुट-विशिष्ट प्रीसिनेप्टिक उत्तेजना असंभव हो जाती है। यह समस्याग्रस्त है क्योंकि विभिन्न सिनैप्टिक इनपुट में भिन्न शारीरिक गुण हो सकते हैं; इसलिए, उनकी सह-उत्तेजना से सिनैप्टिक फिजियोलॉजी का गलत लक्षण वर्णन हो सकता है।
ऑप्टोजेनेटिक्स के आगमन, फोटोसेंसिटिव झिल्ली प्रोटीन (ऑप्सिन) जैसे चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) के आनुवंशिक एन्कोडिंग ने मस्तिष्क क्षेत्रों10,11 के बीच पृथक सिनैप्टिक अनुमानों का अध्ययन करने के लिए संभावनाओं के विशाल विस्तार की अनुमति दी है। यहां हम लंबी दूरी के सिनैप्टिक फिजियोलॉजी और प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए एक सामान्य और कम लागत वाले समाधान का वर्णन करते हैं। ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं को वायरल वैक्टर का उपयोग करके अत्यधिक विशिष्ट तरीके से वितरित किया जाता है जो रुचि के पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र के अत्यंत सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है। अपवाही अनुमान प्रकाश-सक्रिय चैनल को व्यक्त करेंगे जो एक लक्ष्य क्षेत्र में इन तंतुओं के सक्रियण की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, लंबी दूरी, शारीरिक रूप से फैलाने वाले मार्ग जिन्हें पारंपरिक, गैर-विशिष्ट, विद्युत उत्तेजना द्वारा स्वतंत्र रूप से सक्रिय नहीं किया जा सकता है, का अध्ययन किया जा सकता है।
हम एक उदाहरण मार्ग के रूप में, एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) एन्कोडिंग उत्तेजक केशन-चैनल ऑप्सिन के साथ मेडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी) के पारगमन का वर्णन करते हैं। फिर हम पार्श्व एंटोरिनल कॉर्टेक्स (एलईसी) से तीव्र स्लाइस की तैयारी, परत 5 एलईसी पिरामिड न्यूरॉन्स से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग, और ग्लूटामेटर्जिक एमपीएफसी-एलईसी अनुमानों के प्रकाश-उत्पन्न सक्रियण का वर्णन करते हैं (चित्रा 1)। हम रुचि के पूर्व-सिनैप्टिक क्षेत्र के स्थान और पोस्ट-सिनैप्टिक सेल आकृति विज्ञान की पहचान की पुष्टि करने के लिए इंजेक्शन साइट के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन का भी वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एएवी एन्कोडिंग ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं और तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रदान करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के संयोजन का उपयोग करके अत्यधिक विशि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वेलकम अनुदान 206401 / जेड / 17 / जेड द्वारा समर्थित है। हम जफर बशीर को उनके विशेषज्ञ मेंटरशिप के लिए और डॉ क्लेयर बूथ को पांडुलिपि पर तकनीकी सहायता और टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
Referências
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