Denne protokollen beskriver en standardisert evaluering av legemiddelfølsomhet til målrettede signalhemmere i NSCLC pasientavledede organoidmodeller.
Nye 3D kreft organoid kulturer avledet fra kliniske pasientprøver representerer et viktig modellsystem for å evaluere intratumor heterogenitet og behandlingsrespons på målrettede hemmere i kreft. Banebrytende arbeid innen gastrointestinale og bukspyttkjertelkreft har fremhevet løftet om pasientavledede organoider (PUD) som et pasient-proksimalt kultursystem, med et økende antall modeller som dukker opp. På samme måte har arbeid i andre krefttyper fokusert på å etablere organoidmodeller og optimalisere kulturprotokoller. Spesielt opprettholder 3D-kreftorganoidmodeller den genetiske kompleksiteten til originale tumorprøver og oversetter dermed tumoravledede sekvenseringsdata til behandling med genetisk informerte målrettede terapier i eksperimentelle omgivelser. Videre kan PUD-er fremme evaluering av rasjonelle kombinasjonsbehandlinger for å overvinne resistensrelatert tilpasning av svulster i fremtiden. Sistnevnte fokuserer på intens forskningsinnsats i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), da resistensutvikling til slutt begrenser behandlingssuksessen til målrettede hemmere. En tidlig vurdering av terapeutisk målrettede mekanismer ved bruk av NSCLC-PUD-er kan bidra til å informere rasjonelle kombinasjonsbehandlinger. Dette manuskriptet beskriver en standardisert protokoll for cellekulturens platebaserte vurdering av legemiddelfølsomhet til målrettede hemmere i NSCLC-avledede 3D-PUD-er, med potensiell tilpasningsevne til kombinasjonsbehandlinger og andre behandlingsmodaliteter.
Personlige terapier mot onkogene sjåfører har revolusjonert kreftbehandling, forbedret pasientens overlevelse og redusert behandlingsmedierte bivirkninger1. Nylige fremskritt innen molekylær diagnostikk og sekvenseringsteknologier har fremhevet kompleksiteten i menneskelige svulster, med romlig og tidsmessig heterogenitet som påvirker behandlingsresponsen2. Recapitulating av disse subklonale forskjellene i cellekulturmodeller har lenge vært begrenset til å undersøke utvalgte endringer av interesse for ellers ensartede cellelinjer. Nyutviklede 3D PUD-modeller generert fra tumorbiopsier eller kirurgiske tumorreseksjoner gir mulighet for forbedret representasjon av cellulær kompleksitet og signal krysstale i pasientavledede tumorvev3. Som sådan har tumororganoider avledet fra gastrointestinal og bukspyttkjertelkreft blitt generert og rekapitulert det genetiske mangfoldet og determinanter for behandlingsrespons4,5,6. I ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) anerkjennes organoidutvikling og etableringsutfordringer, og optimalisering av kulturteknikker og selektive mediefaktorer er nødvendig for å muliggjøre bredere og mer systematisk bruk av NSCLC-PUD-er i fremtiden7,8.
Å utvikle kombinatoriske terapier rettet mot gjenværende tumorceller som tåler første legemiddelbehandling er avgjørende for å hemme resistensutvikling og til slutt forbedre pasientens overlevelse9. Gitt den arkitektoniske kompleksiteten til organoide kulturer, må klassiske legemiddelresponsparametere optimaliseres for å muliggjøre nøyaktig og reproduserbar testing av narkotikafølsomhet. Bildebaserte avlesninger10,11 og klassiske celle levedyktighetsanalyser som måler cellulær ATP-overflod6,12, blant andre teknikker, er tilgjengelige for å profilere narkotikaresponser i PUD-kulturer. Her utvikler og beskriver vi en standardisert protokoll for å evaluere legemiddelfølsomhet til målrettet terapi mot kjente kliniske drivere i NSCLC PUD-modeller.
Dette manuskriptet utvikler og beskriver en standardisert protokoll for vurdering av legemiddelfølsomhet i NSCLC-avledede 3D PUD-modeller. I tillegg til legemiddelfølsomhetsstudier er det nødvendig med ytterligere karakterisering av tilgjengelige organoidmodeller for å bestemme de underliggende årsakene til forskjeller i legemiddelfølsomhet. Dette kan omfatte genetisk profilering av organoider og pasientprøver og annen analyse tilgjengelig for organoider, for eksempel immunhiistokjemifarging for differensieringsmarkører og generelle cellulære signalbiomarkører og fysiologi13,29.
Kritiske trinn i protokollen
Protokollen som er skissert her, gir en standardisert arbeidsflyt som muliggjør nøyaktige og reproduserbare legemiddelfølsomhetsanalyser når de følges nøye. Spesiell forsiktighet bør tas i følgende trinn: TrypLE og DNAse I fordøyelse under generering av encellede suspensjoner, såing av encellede suspensjoner i BME2, overvåking av organoid vekst til behandling, medieforandringer og forstyrrelser og lysis av BME2 innebygde organoider under luminescensbasert celleoverlevelsesavlesning. (1) Mens ytterligere DNAse I fordøyelse etter TrypLE-basert dissosiasjon av organoider ikke er avgjørende for å utvide organoidmodeller under regelmessig kulturvedlikehold, bør DNAse I fordøyelsen ikke utelates ved såing for narkotikaeskaleringsforsøk, da det sikrer bedre separasjon av organoidklynger i encellede suspensjoner og nøyaktig celletelling. (2) Såing av encellet suspensjon i BME2 representerer et kritisk skritt gitt størkning av BME2 ved romtemperatur. Dermed må maksimalt 1-2 rader frøs samtidig, og prøver bør plasseres på is før flere rader blir sådd. Vær oppmerksom på at celler må pipettes opp og ned når sådd fortsetter å tillate en homogen celleoppheng. (3) Organoid vekst må overvåkes nøye under 7-dagers ekspansjon fra såing til behandling. Et eksempel på forventet utvikling er gitt i figur 1B og supplerende tabell 1. Vær oppmerksom på at vurdering av endringer i organoid størrelse ved brightfield-mikroskopi og bildeanalyse som presentert i figur 1B kan muliggjøre en presis evaluering av forskjeller i organoid vekst og dobling av tider. Dobling av tidene kan ha innvirkning på narkotikaresponsen, som nylig omtalt i litteraturen30. Hvis den organoide vekstraten overstiger det presenterte eksemplet betydelig, kan en kortere ekspansjonstid til behandlingsstart og kortere behandlingsvarighet vurderes. (4) I tillegg bør det utvises spesiell forsiktighet ved bytte av medier for å unngå aspirerende organoider. Såingsposisjonen til BME2 innebygde organoider ved 6-tiden tillater en sikker aspirasjon av medier når platene dreies med klokken med 180° og media aspireres i motsatt posisjon av organoidene. (5) Endelig er grundig lysis av BME2 innebygde organoider under overlevelsesavlesningen viktig for å registrere nøyaktige resultater. I henhold til produsentens instruksjoner bør prøvene pipettes opp og ned gjentatte ganger, ideelt ved hjelp av ufiltrerte spisser, for å sikre riktig lysis. Inkubasjonstider bør følges som beskrevet. Videre overfører 75% av lysatet (i stedet for det totale volumet) til en hvit, ugjennomsiktig bunn 96-brønnsplate for den endelige avlesningen ved hjelp av en ELISA-plateleser gir en passende vurdering, da dette sikrer samme volum i hver brønn og fraværet av luftbobler som kan introduseres ved kraftig pipettering.
Vær oppmerksom på at profilering av legemiddelresponser i BME2-innebygde organoidkulturer kan vise et høyere standardavvik enn observert i vanlige cellelinjekulturer (figur 2, figur 3A). Det høyere standardavviket er basert på flere faktorer, inkludert økt sannsynlighet for mindre variasjoner i såing i arbeid med BME2 og forskjeller i individuelle organoid vekstrater på tvers av brønner i løpet av den første 7-dagers vekstperioden. Dermed bør like eller mer enn fire tekniske repliker per legemiddelkonsentrasjon bli sådd.
Viktigst av alt, tilstedeværelsen av ondartede celler som bærer den onkogene drivermutasjonen og begrenset forurensning av normale epitelceller i luftveiene, må vurderes nøye. Utfordringer i NSCLC-etablissementet kan favorisere utveksten av normale epitelceller i luftveiene7. Kopinummerprofilering eller PCR- og sekvenseringsbaserte tilnærminger for å bekrefte tilstedeværelsen av de onkogene drivermutasjonene er de valgte metodene for å sikre kvaliteten på NSCLC organoidkulturer.
Endringer og feilsøking av metoden
Medier og respektive vekstfaktorer som legges til grunnleggende medieløsninger, kan ha betydelig innvirkning på legemiddelresponsen på målrettede hemmere. De aktiverer bypass-reseptorer og signalveier som påvirker og begrenser legemiddelresponsen (f.eks. FGF, HGF, EGF)26. Mens en vekstfaktorrik og skreddersydd media kan være optimal for å utvide organoidkulturen, bør narkotikaeskalering og følsomhetsvurderinger utføres i et redusert vekstfaktormedium, som beskrevet ovenfor. Dette er basert på intern erfaring med å sammenligne ulike medieformuleringer og legemiddelresponsdata (figur 3C). Mens medieløsninger kan påvirke graden av følsomhet for visse legemiddelbehandlinger og kan endre IC50-verdier, er robuste fenotyper av følsomhet eller resistens tydelig uavhengig av medieformulering (figur 3C,D). I tillegg anbefales generell konsistens i medieformuleringen og profilering av legemiddelresponser på tvers av organoidkulturer, og en lik eller mer enn fire tekniske replikerer per konsentrasjon må frøes. Dette er spesielt viktig for referanseområdene i sensitivitet kontra. motstand for inhibitor av interesse.
Begrensninger ved metoden
Protokollen som presenteres her beskriver følsomheten til NSCLC 3D kreft organoid modeller til målrettede hemmere når pasientavledede kreftceller dyrkes. Ytterligere eksperimenter, inkludert farmakodynamisk analyse om banehemming og sekvenseringsanalyse for tilstedeværelsen av driver oncogene og sekundære mutasjoner, er nødvendig for en detaljert karakterisering av legemiddelresistens og følsomhet. Videre er det ikke gjort rede for tilskuerfaktorer som mikromiljøstimuli avledet fra interaksjoner eller utskilte faktorer av ikke-kreft-tilskuerceller i tumormikromiljøet, og nye protokoller er nødvendig når kokulturorganoidmodeller med immun- eller stromalceller forsøkes. Nyere arbeid har fremhevet bruken av organoidmodeller for å rekapitulere tumormikromiljøinteraksjoner og profilresponser på immunkontrollpunkthemmere, for eksempel anti-PD-L1-behandling13,31.
Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende / alternative metoder
3D kreft organoid modeller rekapitulere genetisk mangfold og determinanter av behandlingsrespons tilstede i den opprinnelige svulsten4,5,6. Spesielt kan romlig og temporal heterogenitet fremme tumorutvikling, og parallell fremvekst og sekvensiell utvikling av tumor subclones kan forekomme32,33. Intratumor heterogenitet er viktig for valg av mer elastiske tumorceller under terapeutisk trykk9,34,35. Protokollen som er gitt her tillater en rask vurdering av følsomheter for behandling med målrettede hemmere i pasient-proksimale prøver. Dermed har organoidmodeller fordeler i forhold til mer konvensjonelle homogene cellelinjemodeller som mangler genetisk mangfold eller langsiktige studier ved hjelp av cellelinjer eller pasientavledede xenografter. Videre tillater den nåværende protokollen skalering av opptil flere behandlingsvåpen og kombinasjonsbehandlingsmetoder med få begrensninger når det gjelder kostnads- og analysekapasitet. Som sådan, å legge til et annet stoff av interesse ved en fast dose mens du eskalerer den primært målrettede inhibitoren og sammenligner den med eskaleringen av den primært målrettede inhibitoren alene, gjør det mulig å effektivt evaluere de potensielle kombinatoriske effektene og med minimal ekstra biomasse som kreves (Supplerende figur 3). Sammenlignet med bildebaserte vurderinger som brukes til å overvåke organoid utvikling og legemiddelrespons, har den luminescensbaserte celleoverlevelsesanalysen beskrevet her lignende følsomhet med minimalt utstyr og opplæring som kreves.
Viktigheten og potensielle anvendelser av metoden på spesifikke forskningsområder
Utvikling av en standardisert rørledning som gjør det mulig å etablere kreftorganoidmodeller fra pasientprøver og den påfølgende legemiddelfølsomhetsprofileringen har et betydelig klinisk anvendbarhetspotensial. Ex vivo farmakologisk profilering har fått anerkjennelse i å oppdage sårbarheter og resistente assosierte egenskaper i svulster, korrelerer med behandlingsrespons hos pasienter36,37. Eks vivoprofilering av legemiddelfølsomheter kan være viktig, og kan hjelpe til med behandlingsvalg i klinikken og utformingen av rasjonelle kombinasjonsbehandlinger som omhandler resistensmekanismer. Samlet sett kan denne tilnærmingen bidra til å muliggjøre forbedrede personlige strategier for molekylær terapi eller kombinatoriske behandlingsregimer. Sistnevnte kan bidra til å målrette narkotikatoleranse og resistensmekanismer tidlig og utdype klinisk respons for å forbedre pasientresultatene i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker laboratoriene til Jeroen P Roose (UCSF) og Calvin J Kuo (Stanford) for deres innspill om organoid kultur og protokollutvikling. Vi takker videre Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) for protokoller og innspill til prøvebedrifter. Dette forskningsprosjektet ble gjennomført med støtte fra NIH [U54CA224081]. F. Haderk ble støttet av Mildred Scheel postdoktorstipend fra den tyske krefthjelpen.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |