Denne protokol beskriver en standardiseret evaluering af lægemiddelfølsomheder over for målrettede signalhæmmere i NSCLC-patientafledte organoidmodeller.
Nye 3D-kræftorganoidkulturer afledt af kliniske patientprøver repræsenterer et vigtigt modelsystem til evaluering af intratumorheterogenitet og behandlingsrespons på målrettede hæmmere i kræft. Banebrydende arbejde inden for mave-tarm- og bugspytkirtelkræft har fremhævet løftet om patientafledte organoider (PTO’er) som et patient-nært-dyrkningssystem, hvor et stigende antal modeller dukker op. Tilsvarende har arbejdet i andre kræfttyper fokuseret på at etablere organoidmodeller og optimere kulturprotokoller. Især 3D-kræftorganoidmodeller opretholder den genetiske kompleksitet af originale tumorprøver og oversætter således tumorafledte sekventeringsdata til behandling med genetisk informerede målrettede terapier i en eksperimentel indstilling. Endvidere kan PPO’er fremme evalueringen af rationelle kombinationsbehandlinger for at overvinde resistensassocieret tilpasning af tumorer i fremtiden. Sidstnævnte fokuserer på intens forskningsindsats inden for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), da resistensudvikling i sidste ende begrænser behandlingssuccesen for målrettede hæmmere. En tidlig vurdering af terapeutisk målbare mekanismer ved hjælp af NSCLC PPO’er kan hjælpe med at informere rationelle kombinationsbehandlinger. Dette manuskript beskriver en standardiseret protokol til cellekulturpladebaseret vurdering af lægemiddelfølsomheder over for målrettede hæmmere i NSCLC-afledte 3D-PPO’er med potentiel tilpasningsevne til kombinationsbehandlinger og andre behandlingsmetoder.
Personlige terapier mod onkogene drivere har revolutioneret kræftbehandlingen, forbedret patientens overlevelse og reduceret behandlingsmedierede bivirkninger1. Nylige fremskridt inden for molekylær diagnostik og sekventeringsteknologier har fremhævet kompleksiteten af humane tumorer, hvor rumlig og tidsmæssig heterogenitet påvirker behandlingsrespons2. Rekapitulerelse af disse subklonale forskelle i cellekulturmodeller har længe været begrænset til at undersøge udvalgte ændringer af interesse i ellers ensartede cellelinjer. Nyudviklede 3D BOB-modeller genereret af tumorbiopsier eller kirurgiske tumorresektioner giver mulighed for forbedret repræsentation af cellulær kompleksitet og signalering af krydstale inden for patientafledt tumorvæv3. Som sådan er tumororganoider afledt af gastrointestinal og bugspytkirtelkræft med succes blevet genereret og rekapitulere den genetiske mangfoldighed og determinanter for behandlingsrespons4,5,6. I forbindelse med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) anerkendes organoidudviklings- og etableringsudfordringer, og der er behov for optimering af dyrkningsteknikker og selektive mediefaktorer for at muliggøre en bredere og mere systematisk anvendelse af NSCLC-PDO’er i fremtiden7,8.
Udvikling af kombinatoriske terapier rettet mod resterende tumorceller, der modstår indledende lægemiddelbehandling, er afgørende for at hæmme resistensudvikling og i sidste ende for at forbedre patientens overlevelse9. I betragtning af organoidkulturernes arkitektoniske kompleksitet skal klassiske lægemiddelresponsparametre optimeres for at muliggøre nøjagtig og reproducerbar test af lægemiddelfølsomheder. Billeddannelsesbaserede udlæsninger10,11 og klassiske cellelevedygtighedsassays, der måler cellulær ATP-overflod6,12, blandt andre teknikker, er tilgængelige for at profilere lægemiddelresponser i BOB-kulturer. Her udvikler og beskriver vi en standardiseret protokol til evaluering af lægemiddelfølsomhed over for målrettet terapi mod kendte kliniske drivere i NSCLC BOB-modeller.
Dette manuskript udvikler og beskriver en standardiseret protokol til vurdering af lægemiddelfølsomhed i NSCLC-afledte 3D BOB-modeller. Ud over lægemiddelfølsomhedsundersøgelser er der behov for yderligere karakterisering af tilgængelige organoidmodeller for at bestemme de underliggende årsager til forskelle i lægemiddelfølsomhed. Dette kan omfatte genetisk profilering af organoider og patientprøver og anden analyse til rådighed for organoider, såsom immunohistokemifarvning til differentieringsmarkører og generelle cellulære signalbiomarkører og fysiologi13,29.
Kritiske trin i protokollen
Protokollen, der er beskrevet heri, giver en standardiseret arbejdsgang, der muliggør nøjagtige og reproducerbare lægemiddelfølsomhedsanalyser, når de følges nøje. Der skal udvises særlig forsigtighed i følgende trin: TrypLE og DNAse I fordøjelse under generering af enkeltcellesuspensioner, såning af enkeltcellesuspensioner i BME2, overvågning af organoidvækst indtil behandling, medieændringer og forstyrrelse og lysis af BME2-indlejrede organoider under luminescensbaseret celleoverlevelsesudlæsning. (1) Mens yderligere DNAse I-fordøjelse efter TrypLE-baseret dissociation af organoider ikke er afgørende for at udvide organoidmodeller under regelmæssig dyrkningsvedligeholdelse, bør DNAse I-fordøjelsen ikke udelades ved podning til lægemiddeleskaleringsforsøg, da det sikrer bedre adskillelse af organoidklynger i enkeltcellesuspensioner og nøjagtig celletælling. (2) Såning af enkeltcellesuspension i BME2 udgør et kritisk trin i betragtning af størkningen af BME2 ved stuetemperatur. Således skal maksimalt 1-2 rækker sås på én gang, og prøver skal placeres på is, før yderligere rækker sås. Bemærk, at celler skal pipetteres op og ned, når såning fortsættes for at muliggøre en homogen cellesuspension. (3) Organoidvæksten skal overvåges nøje i løbet af 7-dages udvidelsen fra såning til behandling. Et eksempel på den forventede udvikling findes i figur 1B og supplerende tabel 1. Det bemærkes, at vurderingen af ændringer i organoidstørrelsen ved hjælp af lysfeltmikroskopi og billedanalyse som vist i figur 1B kan muliggøre en præcis evaluering af forskelle i organoidvækst og fordoblingstider. Fordoblingstider kan have indflydelse på lægemiddelresponser, som for nylig diskuteret i litteraturen30. Hvis den organoide væksthastighed overstiger det præsenterede eksempel betydeligt, kan en kortere ekspansionstid indtil behandlingens start og kortere behandlingsvarighed overvejes. (4) Desuden bør der være særlig forsigtighed ved skift af medier for at undgå aspirerende organoider. Såningspositionen af BME2-indlejrede organoider ved klokken 6 muliggør en sikker aspiration af medier, når pladerne drejes med uret med 180 °, og medier aspireres i den modsatte position af organoiderne. (5) Endelig er grundig lysis af BME2-indlejrede organoider under overlevelsesaflæsningen afgørende for at registrere nøjagtige resultater. I henhold til producentens anvisninger skal prøver pipetteres op og ned gentagne gange, ideelt set ved hjælp af ufiltrerede spidser, for at sikre korrekt lysis. Inkubationstider skal følges som beskrevet. Endvidere giver overførsel af 75% af lysatet (i stedet for det samlede volumen) til en hvid, uigennemsigtig bundplade med 96 brønde til den endelige udlæsning ved hjælp af en ELISA-pladelæser mulighed for en passende vurdering, da dette sikrer det samme volumen i hver brønd og fraværet af luftbobler, der kan indføres ved kraftig pipettering.
Det bemærkes, at profilering af lægemiddelresponser i BME2-indlejrede organoidkulturer kan vise en højere standardafvigelse end observeret i almindelige cellelinjekulturer (figur 2, figur 3A). Den højere standardafvigelse er baseret på flere faktorer, herunder en øget sandsynlighed for mindre variationer i såning ved arbejde med BME2 og forskelle i individuelle organoidvækstrater på tværs af brønde i løbet af den indledende 7-dages vækstperiode. Således bør der sås lig med eller mere end fire tekniske replikater pr. Lægemiddelkoncentration.
Vigtigst er det, at tilstedeværelsen af maligne celler, der bærer den onkogene drivermutation og begrænset forurening med normale luftvejsepitelceller, skal evalueres omhyggeligt. Udfordringer i NSCLC-etablering kan favorisere udvæksten af normale luftvejsepitelceller7. Kopinummerprofilering eller PCR- og sekventeringsbaserede tilgange til bekræftelse af tilstedeværelsen af de onkogene drivermutationer er de valgte metoder til at sikre kvaliteten af NSCLC-organoidkulturer.
Ændringer og fejlfinding af metoden
Medier og respektive vækstfaktorer tilføjet til grundlæggende medieløsninger kan påvirke lægemiddelresponset på målrettede hæmmere betydeligt. De aktiverer bypassreceptorer og signalveje, der påvirker og begrænser lægemiddelrespons (f.eks. FGF, HGF, EGF)26. Mens et vækstfaktorrigt og skræddersyet medie kan være optimalt til at udvide organoidkulturen, bør lægemiddeleskalering og følsomhedsvurderinger udføres i et reduceret vækstfaktormedie som beskrevet ovenfor. Dette er baseret på intern erfaring med at sammenligne forskellige medieformuleringer og lægemiddelresponsdata (figur 3C). Mens medieløsninger kan påvirke graden af følsomhed over for visse lægemidler og kan ændre IC50-værdier, er robuste fænotyper af følsomhed eller resistens tydelige uanset medieformulering (figur 3C,D). Derudover anbefales generel konsistens i medieformuleringen og profilering af lægemiddelresponser på tværs af organoidkulturer, og en lige eller mere end fire tekniske replikater pr. Koncentration skal podes. Dette er især vigtigt for benchmarkintervaller i følsomhed vs. modstand mod inhibitoren af interesse.
Begrænsninger af metoden
Protokollen, der præsenteres her, beskriver følsomheden af NSCLC 3D-kræftorganoidmodeller over for målrettede hæmmere, når patientafledte kræftceller dyrkes. Yderligere forsøg, herunder farmakodynamisk analyse vedrørende pathway hæmning og sekventering analyse for tilstedeværelsen af driver onkogen og sekundære mutationer, er nødvendige for en detaljeret karakterisering af lægemiddelresistens og følsomhed. Endvidere tages der ikke højde for tilskuerfaktorer såsom mikromiljømæssige stimuli afledt af interaktioner eller udskillede faktorer af ikke-kræftbystanderceller i tumormikromiljøet, og der er behov for nye protokoller, når der forsøges organoidmodeller med immun- eller stromalceller. Nyligt arbejde har fremhævet brugen af organoidmodeller til at rekapitulere tumormikromiljøinteraktioner og profilresponser på immun checkpoint-hæmmere, såsom anti-PD-L1-behandling13,31.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
3D-kræftorganoidmodeller rekapitulerer den genetiske mangfoldighed og determinanter for behandlingsrespons, der er til stede i den oprindelige tumor4,5,6. Især kan rumlig og tidsmæssig heterogenitet fremme tumorudvikling, og parallel fremkomst og sekventiel udvikling af tumorsubkloner kan forekomme32,33. Intratumorheterogenitet er signifikant for udvælgelsen af mere modstandsdygtige tumorceller under terapeutisk tryk9,34,35. Protokollen, der gives her, giver mulighed for en hurtig vurdering af følsomheder over for behandling med målrettede hæmmere i patientnærprøver. Organoidmodeller har således fordele i forhold til mere konventionelle homogene cellelinjemodeller, der mangler genetisk mangfoldighed eller langsigtede undersøgelser ved hjælp af cellelinjer eller patientafledte xenografts. Desuden tillader den nuværende protokol opskalering til flere behandlingsarme og kombinationsbehandlingsmetoder med få begrænsninger med hensyn til omkostninger og analytisk kapacitet. Som sådan giver tilføjelse af et andet lægemiddel af interesse i en fast dosis, samtidig med at den primært målrettede hæmmer eskaleres og sammenlignes med eskaleringen af den primært målrettede hæmmer alene, mulighed for effektivt at evaluere de potentielle kombinatoriske virkninger og med minimal yderligere biomasse, der kræves (supplerende figur 3). Sammenlignet med billeddannelsesbaserede vurderinger, der bruges til at overvåge organoidudvikling og lægemiddelrespons, har det luminescensbaserede celleoverlevelsesassay, der er beskrevet her, lignende følsomhed med minimalt udstyr og træning, der kræves.
Metodens betydning og potentielle anvendelsesmuligheder inden for specifikke forskningsområder
Udvikling af en standardiseret pipeline, der gør det muligt at etablere kræftorganoidmodeller fra patientprøver og den efterfølgende profilering af lægemiddelfølsomheder, har et betydeligt klinisk anvendelighedspotentiale. Ex vivo farmakologisk profilering har opnået anerkendelse ved påvisning af sårbarheder og resistente associerede træk i tumorer, der korrelerer med behandlingsrespons hos patienter36,37. Det er bemærkelsesværdigt, at ex vivo-profilering af lægemiddelfølsomheder kan hjælpe med behandlingsvalg i klinikken og design af rationelle kombinationsbehandlinger, der adresserer resistensmekanismer. Samlet set kan denne tilgang bidrage til at muliggøre forbedrede personlige strategier for molekylær terapi eller kombinatoriske behandlingsregimer. Sidstnævnte kan hjælpe med at målrette lægemiddeltolerance og resistensmekanismer tidligt og uddybe klinisk respons for at forbedre patientresultaterne i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker laboratorierne Jeroen P Roose (UCSF) og Calvin J Kuo (Stanford) for deres input vedrørende organoidkultur og protokoludvikling. Vi takker endvidere Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) for protokoller og input fra prøveetablering. Dette forskningsprojekt blev gennemført med støtte fra NIH [U54CA224081]. F. Haderk blev støttet af Mildred Scheel postdoc-stipendiet fra den tyske kræfthjælp.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |