Hipokampus ilk olarak 1500’lü^yıllarda bir Bolognese anatomisti olan Giulio Cesare Aranzio tarafından tanımlanmıştır. Bu yeni keşfedilen yapıyı adlandırırken, Aranzio muhtemelen Hipokampus¹ cinsinin denizatına olan esrarengiz benzerliğinden ilham aldı. Hipokampus stres tepkilerinde rol oynar, ancak öğrenme ve hafızadaki rolü ile yaygın olarak bilinir. Daha spesifik olarak, hipokampus, bildirimsel ve uzamsal belleğin kodlanmasından ve alınmasından sorumludur¹.

Hipokampus veya uygun hipokampus, CA1 (cornu ammonis), CA2 ve CA3 alt alanları^1’e ayrılmıştır. Sinir sisteminin geri kalanıyla karşılaştırıldığında, hipokampus, plastisitesi ve devam eden nörogenez^potansiyeli de dahil olmak üzere birçok benzersiz tanımlayıcı özelliğe sahiptir 2. Nörogenez, nöral kök hücrelerin çoğalması ve farklılaşması sürecidir, bunu takiben önceden var olan nöronal ağa entegrasyonları izler. Nörogenez, dentat girusun subgranüler bölgesi ve lateral ventriküllerin (ve koku alma ampullerinin) subventriküler bölgesi ile ^{sınırlıdır3}. Nörogenez embriyogenezde bol miktarda bulunurken, yaşam boyu süren bir süreçtir ^3,4. Bu nedenle, bu tartışma hipokampustaki yetişkin nörogenezine odaklanacaktır.

Subventriküler ve subgranüler bölgeler, ependimal ve vasküler hücrelerin yanı sıra nöral kök hücrelerin olgunlaşmamış ve olgun soylarını içeren nörojenik nişlerdir⁵. Mikroglia, nörogenezi düzenlemek için bağışıklık hücreleri olarak bu nişlere katkıda bulunur⁶. Nöral progenitör hücreler, nöral kök hücrelerin kök hücre dışı soylarıdır⁷. Subventriküler bölgede üç tip nöral progenitör bulunur: radyal glia benzeri tip B hücreleri, C tipi transitif yükseltici progenitörler ve tip A nöroblastları ^3,8. Subventriküler bölgedeki yavaş bölünen tip B nöral progenitör hücreler, hızla bölünen tip C hücrelerine farklılaşabilir⁸. Daha sonra, C tipi hücreler A tipi hücrelere⁸ olarak farklılaşır. Bu nöroblastlar, internöronlara veya oligodendrositlere farklılaşmadan önce rostral göç akışından koku alma ampulüne göç eder⁹. Bu koku alma ampulü internöronları, koku alma kısa süreli hafızanın ve ilişkisel öğrenmenin anahtarıdır, oysa oligodendrositler korpus kallozum^9’un miyelinli aksonlarını oluşturur. Erişkin nörogenezin çoğunluğu, radyal tip 1 ve radyal olmayan tip 2 nöral progenitörlerin bulunduğu dentat girusun subgranüler bölgesinde meydana gelir³. Çoğu nöral progenitör hücre, dentat granül nöronları ve astrositler haline gelmeye mahkumdur¹⁰. Boşluk kavşaklarıyla birbirine bağlanan astrositler, plastisiteyi, sinaptik aktiviteyi ve nöronal uyarılabilirliği modüle etmek için ağlar oluşturur⁵. Dentat girusun birincil uyarıcı nöronu olarak, granül hücreler entorinal korteksten CA3 bölgesi^11’e girdi sağlar.

Nöral kök hücre popülasyonları immünomanyetik veya immünofloresan izolasyon stratejileri kullanılarak izole edilebilir^12,13. Nöral dokunun ayrışması özellikle zordur; Bunu yapma çabaları genellikle zayıf hücre canlılığına sahip numunelerle sonuçlanır ve / veya aşağı akış analizi için gerekli tek hücreli süspansiyonu üretemez. Nöral ayrışma, mekanik ayrışma (filtreler, doğrama teknikleri veya pipet tritürasyonu gibi), enzimatik sindirim veya tekniklerin bir kombinasyonu yoluyla gerçekleştirilebilir^14,15. Nöral ayrışma yöntemlerini değerlendiren bir çalışmada, pipet tritürasyonu ile manuel mekanik ayrışmanın canlılığı ve kalitesi ile pipet tritürasyonu ve sindiriminin çeşitli enzimlerle kombinasyonları karşılaştırılmıştır¹⁵. Kalite, hazırlanan süspansiyondaki hücre kümelerinin ve DNA veya hücre altı kalıntıların miktarına göre derecelendirildi¹⁵. Tek başına manuel mekanik ayrışmaya maruz kalan glial tümörlerin süspansiyonları, dispazlı tedavilerden veya DNaz, kollajenaz ve hyaluronidaz^15’in bir kombinasyonundan önemli ölçüde daha düşük hücre canlılığına sahipti. Volovitz ve ark., farklı yöntemler arasındaki canlılık ve kalitedeki çeşitliliği kabul etmiş ve yetersiz ayrışmanın aşağı akış analizinin doğruluğunu azaltabileceğini vurgulamıştır¹⁵.

Ayrı bir çalışmada, yazarlar kültürlü nöronal hücrelerin ayrışmasının 60’tan fazla farklı yöntemini ve kombinasyonunu karşılaştırdılar¹⁴. Bu yöntemler, pipet tritürasyonu ile manuel mekanik ayrışmanın sekiz farklı varyasyonunu, üç farklı aralıkta beş ayrı enzimle inkübasyonun karşılaştırılmasını ve enzimatik sindirim veya iki enzimin kombinasyonu ile çeşitli mekanik ayrışma kombinasyonlarını içeriyordu¹⁴. Mekanik yöntemlerin hiçbiri tek hücreli bir süspansiyon¹⁴ vermedi. Tek enzim tedavilerinden dördü, enzimatik tedavilerin on kombinasyonu ve enzimatik sindirim ile mekanik ayrışma kombinasyonlarının dördü tek hücreli bir süspansiyon¹⁴ verdi. TrypLE ile enzimatik sindirim ve ardından Tripsin-EDTA en etkili şekilde ayrışmış örnekler¹⁴. Bu arada, TrypLE ve / veya Trypsin-EDTA ile muamele edilen örnekler jelatinimsi kümeler oluşturma eğilimindeydi¹⁴. Bu çalışma kültürlenmiş hücreler üzerinde yapılırken, pipet tritürasyonu veya enzimatik sindirimin tek başına eksikliklerine değinmektedir.

Manuel ve otomatik mekanik ayrışmanın yan yana karşılaştırmaları eksiktir. Bununla birlikte, bir grup, ticari papain veya tripsin enzimatik ayrışma kitleri¹⁶ ile birlikte tüm fare beyinlerinin manuel ve yarı otomatik mekanik ayrışmasını karşılaştırmak için akış sitometrisini çalıştırdı. Ayrışıcı ile işleme daha tutarlı bir şekilde canlı hücreler verdi¹⁶. Ayrışmayı takiben, yazarlar ayrıca Prominin-1 hücrelerini, nöronal öncü hücreleri ve mikroglia^16’yı izole ettiler. Üç izole hücre popülasyonundan ikisi için, izole hücrelerin saflığı, örnekler ayrışıcı ile işlendiğinde, manuel olarak^16’ya kıyasla biraz daha yüksekti. Reiß ve ark., pipetleme tekniğinde kişiden kişiye değişkenliğin, doku ayrışmasında canlı hücre popülasyonu veriminin tekrarlanabilirliğini engellediğini belirtmiştir¹⁶. Yazarlar, otomatik mekanik ayrışmanın numune işlemeyi standartlaştırdığı sonucuna varmışlardır¹⁶.

Bu makalede özetlenen ayrışma yöntemi, ticari bir yetişkin beyin ayrışma kiti^17’ye eşlik eden çözeltiler kullanılarak, tam otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimin bir kombinasyonudur. Standart protokollerden farklı olarak, bu optimize edilmiş protokol numune manipülasyonunu azaltır, son derece uygulanabilir tek hücreli bir süspansiyon sağlar ve minimum miktarda başlangıç dokusunun işlenmesi için tasarlanmıştır.