El hipocampo fue descrito por primera vez por un anatomista boloñés, Giulio Cesare Aranzio, en la década de 1500¹. Al nombrar esta nueva estructura, Aranzio probablemente se inspiró en su extraño parecido con el caballito de mar del género Hippocampus¹. El hipocampo está involucrado en las respuestas al estrés, pero es ampliamente conocido por su papel en el aprendizaje y la memoria. Más específicamente, el hipocampo es responsable de la codificación y recuperación de la memoria declarativa y espacial¹.

El hipocampo, o hipocampo propiamente dicho, se divide en los subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 y CA3¹. En comparación con el resto del sistema nervioso, el hipocampo tiene varias características definitorias únicas, incluida su plasticidad y potencial para la neurogénesis en curso². La neurogénesis es el proceso de proliferación y diferenciación de las células madre neurales, seguido de su integración en la red neuronal preexistente. La neurogénesis se restringe a la zona subgranular del giro dentado y a la zona subventricular de los ventrículos laterales (y los bulbos olfativos)³. Si bien la neurogénesis es abundante en la embriogénesis, es un proceso de por vida ^3,4. Como tal, esta discusión se centrará en la neurogénesis adulta en el hipocampo.

Las zonas subventricular y subgranular son nichos neurogénicos que contienen células ependimarias y vasculares, así como linajes inmaduros y maduros de células madre neurales⁵. La microglía contribuye a estos nichos como células inmunes para regular la neurogénesis⁶. Las células progenitoras neurales son progenies de células no madre de células madre neurales⁷. Tres tipos de progenitores neurales están presentes en la zona subventricular: células tipo B similares a la glía radial, progenitores amplificadores de tránsito tipo C y neuroblastos tipo A ^3,8. Las células progenitoras neurales tipo B que se dividen lentamente en la zona subventricular pueden diferenciarse en células tipo C que se dividen rápidamente⁸. Posteriormente, las células de tipo C se diferencian en células de tipo A⁸. Estos neuroblastos migran a través de la corriente migratoria rostral hasta el bulbo olfatorio antes de diferenciarse en interneuronas u oligodendrocitos⁹. Estas interneuronas del bulbo olfatorio son clave para la memoria olfativa a corto plazo y el aprendizaje asociativo, mientras que los oligodendrocitos mielinizan los axones del cuerpo calloso⁹. La mayoría de la neurogénesis adulta ocurre en la zona subgranular del giro dentado, donde se encuentran progenitores neurales radiales tipo 1 y no radiales tipo 2³. La mayoría de las células progenitoras neurales están destinadas a convertirse en neuronas granulosas dentadas y astrocitos¹⁰. Conectados por uniones de brecha, los astrocitos forman redes para modular la plasticidad, la actividad sináptica y la excitabilidad neuronal⁵. Como neurona excitadora primaria del giro dentado, las células granulares proporcionan entrada desde la corteza entorrinal a la región CA3¹¹.

Las poblaciones de células madre neurales pueden aislarse utilizando estrategias de aislamiento inmunomagnético o inmunofluorescente^12,13. El tejido neural es particularmente difícil de disociar; los esfuerzos para hacerlo a menudo resultan en muestras con poca viabilidad celular y / o no producen la suspensión de una sola célula necesaria para el análisis posterior. La disociación neuronal se puede realizar a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de técnicas^14,15. En un estudio que evaluó los métodos de disociación neural, se comparó la viabilidad y calidad de la disociación mecánica manual por trituración de pipetas versus combinaciones de trituración de pipetas y digestión con diversas enzimas¹⁵. La calidad se calificó en función de la cantidad de grupos celulares y ADN o restos subcelulares en la suspensión preparada¹⁵. Las suspensiones de tumores gliales sometidos a disociación mecánica manual sola tuvieron una viabilidad celular significativamente menor que los tratamientos con dispasa o una combinación de DNasa, colagenasa e hialuronidasa¹⁵. Volovitz et al. reconocieron la variación en viabilidad y calidad entre los diferentes métodos y enfatizaron que una disociación inadecuada puede reducir la precisión del análisis aguas abajo¹⁵.

En un estudio separado, los autores compararon más de 60 métodos y combinaciones diferentes de disociación de células neuronales cultivadas¹⁴. Estos métodos incluyeron ocho variaciones diferentes de disociación mecánica manual por trituración de pipetas, una comparación de la incubación con cinco enzimas individuales a tres intervalos diferentes y varias combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática o la combinación de dos enzimas¹⁴. Ninguno de los métodos mecánicos produjo una suspensión de una sola célula¹⁴. Cuatro de los tratamientos de enzima única, diez de los tratamientos enzimáticos combinados y cuatro de las combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática produjeron una suspensión de una sola célula¹⁴. La digestión enzimática con TrypLE seguida de las muestras disociadas de Tripsina-EDTA de manera más efectiva¹⁴. Por cierto, las muestras tratadas con TrypLE y/o Tripsina-EDTA tendían a formar grupos gelatinosos¹⁴. Si bien este estudio se realizó en células cultivadas, habla de las deficiencias de la trituración de pipetas o la digestión enzimática sola.

Faltan comparaciones lado a lado de la disociación mecánica manual versus automatizada. Sin embargo, un grupo ejecutó la citometría de flujo para comparar la disociación mecánica manual y semiautomatizada de cerebros de ratones enteros junto con kits de disociación enzimática de papaína comercial o tripsina¹⁶. El procesamiento con el disociador produjo células viables de manera más consistente¹⁶. Después de la disociación, los autores también aislaron células prominina-1, células precursoras neuronales y microglia¹⁶. Para dos de las tres poblaciones de células aisladas, la pureza de las células aisladas fue ligeramente mayor cuando las muestras se procesaron con el disociador, en comparación con¹⁶ manualmente. Reiß et al. señalaron que la variabilidad de persona a persona en la técnica de pipeteo dificulta la reproducibilidad del rendimiento de la población celular viable en la disociación tisular¹⁶. Los autores concluyeron que la disociación mecánica automatizada estandariza el procesamiento de muestras¹⁶.

El método de disociación descrito en este manuscrito es una combinación de disociación mecánica totalmente automatizada y digestión enzimática, utilizando soluciones que acompañan a un kit comercial de disociación cerebral adulta¹⁷. A diferencia de los protocolos estándar, este protocolo optimizado reduce la manipulación de muestras, produce una suspensión unicelular altamente viable y está destinado a procesar cantidades mínimas de tejido de partida.