O hipocampo foi descrito pela primeira vez por um anatomista bolonhesa, Giulio Cesare Aranzio, em 1500^. Ao nomear esta nova estrutura, Aranzio foi provavelmente inspirado por sua estranha semelhança com o cavalo-marinho do gênero Hipocampo¹. O hipocampo está envolvido em respostas ao estresse, mas é amplamente conhecido por seu papel no aprendizado e na memória. Mais especificamente, o hipocampo é responsável pela codificação e recuperação da memória declarativa e espacial¹.

O hipocampo, ou hipocampo propriamente dito, é dividido nos subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 e CA3¹. Comparado com o resto do sistema nervoso, o hipocampo tem várias características únicas de definição, incluindo sua plasticidade e potencial para neurogênese^{contínua 2}. Neurogênese é o processo de proliferação e diferenciação de células-tronco neurais, seguida por sua integração na rede neuronal pré-existente. A neurogênese é restrita à zona subgranular do giro dentado e da zona subventricular dos ventrículos laterais (e das lâmpadas olfativas)³. Embora a neurogênese seja abundante em embriogênese, é um processo ao longo da vida ^3,4. Como tal, essa discussão se concentrará na neurogênese adulta no hipocampo.

As zonas subventricular e subgranular são nichos neurogênicos contendo células ependísicas e vasculares, bem como linhagens imaturas e maduras de células-tronco neurais⁵. A microglia contribui para esses nichos como células imunes para regular a neurogênese⁶. Progenitoras neurais são progenias não-progenias de células-tronco de células-tronco neurais⁷. Três tipos de progenitores neurais estão presentes na zona subventricular: células tipo B radial, progenitores progenitores do tipo C e neuroblastos tipo A ^3,8. As células progenitoras neurais do tipo B na zona subventricular podem se diferenciar em células tipo C que dividem lentamente⁸. Posteriormente, as células tipo C se diferenciam em células tipo A⁸. Esses neuroblastos migram através do fluxo migratório rostral para a lâmpada olfativa antes de se diferenciarem em interneurons ou oligodendrocytes⁹. Estes interneurônios de bulbo olfativos são fundamentais para a memória olfativa de curto prazo, e aprendizado associativo, enquanto os oligodendrocitos myelinatos axônios do corpus calosum⁹. A maioria da neurogênese adulta ocorre na zona subgranular do giro dentado, onde progenitores neurais radiais tipo 1 e não racial 2 são encontrados³. A maioria das células progenitoras neurais estão destinadas a se tornar neurônios dentes e astrócitos¹⁰. Conectados por junções de lacunas, os astrócitos formam redes para modular plasticidade, atividade sináptica e excitabilidade neuronal⁵. Como o neurônio excitatório primário do giro dentado, as células de grânulo fornecem entrada do córtex entorhinal para a região^{CA3 11}.

As populações de células-tronco neurais podem ser isoladas usando estratégias de isolamento imunomagnético ou imunofluorescente^12,13. O tecido neural é particularmente difícil de dissociar; esforços para fazê-lo muitas vezes resultam em amostras com má viabilidade celular e/ou não produzem a suspensão de célula única necessária para análise a jusante. A dissociação neural pode ser conduzida por meio de dissociação mecânica (como o uso de filtros, técnicas de corte ou trituração de pipetas), digestão enzimática ou uma combinação de técnicas^14,15. Em estudo que avaliou os métodos de dissociação neural, foram comparadas¹⁵ a viabilidade e a qualidade da dissociação mecânica manual por trituração de pipetas versus combinações de trituração de pipetas e digestão com várias enzimas. A qualidade foi classificada com base na quantidade de aglomerados celulares e DNA ou detritos subcelulares na suspensão preparada¹⁵. As suspensões de tumores gliais submetidos apenas à dissociação mecânica manual apresentaram viabilidade celular significativamente menor do que os tratamentos com dispase ou uma combinação de DNase, colagenase e hialuronidase¹⁵. Volovitz et al. reconheceram a variação da viabilidade e da qualidade entre os diferentes métodos e enfatizaram que a dissociação inadequada pode reduzir a precisão da análise a jusante¹⁵.

Em um estudo separado, os autores compararam mais de 60 métodos diferentes e combinações de dissociação de células neuronais cultivadas¹⁴. Estes métodos incluíram oito variações diferentes de dissociação mecânica manual por trituração de pipetas, comparação da incubação com cinco enzimas individuais em três intervalos diferentes, e várias combinações de dissociação mecânica com digestão enzimática ou a combinação de duas enzimas¹⁴. Nenhum dos métodos mecânicos resultou em uma suspensão de célula única¹⁴. Quatro dos tratamentos enzimáticos únicos, dez dos tratamentos enzimáticos combinados, e quatro das combinações de dissociação mecânica com digestão enzimática produziram uma suspensão unicelular¹⁴. Digestão enzimática com TrypLE seguido por Trypsin-EDTA mais efetivamente dissociado amostras¹⁴. Aliás, amostras tratadas com TrypLE e/ou Trypsin-EDTA tendem a formar aglomerados gelatinosos¹⁴. Embora este estudo tenha sido realizado em células cultivadas, ele fala apenas das deficiências da trituração de pipetas ou da digestão enzimática.

Faltam comparações lado a lado de dissociação mecânica manual versus automatizada. No entanto, um grupo executou citometria de fluxo para comparar a dissociação mecânica manual e semi-automatizada de cérebros inteiros de camundongos em conjunto com os kits comerciais de dissociação enzimática papain ou trypsin¹⁶. O processamento com o dissociador produziu de forma mais consistente células viáveis¹⁶. Após a dissociação, os autores também isolaram células prominina-1, células precursoras neuronais e microglia¹⁶. Para duas das três populações celulares isoladas, a pureza das células isoladas foi ligeiramente maior quando as amostras foram processadas com o dissociador, em comparação com^{manualmente 16}. Reiß et al. observaram que a variabilidade de pessoa para pessoa na técnica de pipetagem dificulta a reprodutibilidade do rendimento da população celular viável na dissociação tecidual¹⁶. Os autores concluíram que a dissociação mecânica automatizada padroniza o processamento da amostra¹⁶.

O método de dissociação descrito neste manuscrito é uma combinação de dissociação mecânica totalmente automatizada e digestão enzimática, utilizando soluções que acompanham um kit comercial de dissociação cerebral adulta¹⁷. Ao contrário dos protocolos padrão, este protocolo otimizado reduz a manipulação da amostra, produz uma suspensão de célula única altamente viável, e destina-se a processar quantidades mínimas de tecido inicial.