Hippocampus ble først beskrevet av en bolognesisk anatomist, Giulio Cesare Aranzio, på 1500-1. Ved å navngi denne nyvunne strukturen ble Aranzio sannsynligvis inspirert av sin uhyggelige likhet med sjøhesten til slekten Hippocampus¹. Hippocampus er involvert i stressresponser, men er allment kjent for sin rolle i læring og hukommelse. Mer spesifikt er hippocampus ansvarlig for koding og gjenfinning av deklarativt og romlig minne¹.

Hippocampus, eller hippocampus riktig, er delt inn i CA1 (cornu ammonis), CA2 og CA3 underfelt¹. Sammenlignet med resten av nervesystemet har hippocampus flere unike definerende egenskaper, inkludert plastisitet og potensial for pågående nevrogenese². Neurogenese er prosessen med spredning og differensiering av nevrale stamceller, etterfulgt av deres integrasjon i det eksisterende nevronale nettverket. Neurogenese er begrenset til den subgranulære sonen av dentate gyrus og subventrikulær sone av laterale ventrikler (og olfaktoriske pærer)³. Mens neurogenese er rikelig i embryogenese, er det en livslang prosess ^3,4. Som sådan vil denne diskusjonen fokusere på voksen neurogenese i hippocampus.

De subventrikulære og subgranulære sonene er nevrogene nisjer som inneholder ependymale og vaskulære celler, samt umodne og modne avstamninger av nevrale stamceller⁵. Mikroglia bidrar til disse nisjene som immunceller for å regulere nevrogenese⁶. Nevrale stamceller er nonstem celleavkom av nevrale stamceller⁷. Tre typer nevrale forfedre er til stede i den subventrikulære sonen: radial glia-lignende type B-celler, type C transittforsterkningsforsterkere og type A nevroblaster ^3,8. De langsomt delte type B nevrale stamceller i den subventrikulære sonen kan skille seg ut i raskt å dele type C-celler⁸. Deretter skiller C-celler seg ut i type A-cellene⁸. Disse nevroblaster migrerer gjennom rostral migrasjonsstrømmen til den olfaktoriske pæren før de differensierer til interneuroner eller oligodendrocytter⁹. Disse olfaktoriske pære internurons er nøkkelen til olfaktorisk kortsiktig minne, og assosiativ læring, mens oligodendrocytter myelinate axoner av corpus callosum⁹. Flertallet av voksen neurogenese forekommer i den subgranulære sonen av dentate gyrus, hvor radial type 1 og ikke-radioell type 2 nevrale forfedre er funnet³. De fleste nevrale stamceller er bestemt til å bli dentate granulat nevroner og astrocytter¹⁰. Forbundet med gapkryss danner astrocytter nettverk for å modulere plastisitet, synaptisk aktivitet og nevronal spenning⁵. Som den primære eksitatoriske nevronen i dentate gyrus gir granulatceller innspill fra entorhinal cortex til CA3-regionen¹¹.

Nevrale stamcellepopulasjoner kan isoleres ved hjelp av immunomgnetiske eller immunfluoreserende isolasjonsstrategier^12,13. Nevralt vev er spesielt vanskelig å dissosiere; forsøk på å gjøre dette resulterer ofte i prøver med dårlig celle levedyktighet og / eller unnlater å produsere den nødvendige encellede suspensjonen for nedstrømsanalyse. Nevral dissosiasjon kan utføres via mekanisk dissosiasjon (for eksempel ved hjelp av filtre, hakketeknikker eller pipettetrianturering), enzymatisk fordøyelse eller en kombinasjon av teknikker^14,15. I en studie som evaluerte nevrale dissosiasjonsmetoder, ble levedyktigheten og kvaliteten på manuell mekanisk dissosiasjon ved pipettetrianturering versus kombinasjoner av pipettetrianturering og fordøyelse med ulike enzymer sammenlignet^{med 15}. Kvaliteten ble gradert basert på mengden celleklumper og DNA eller subcellulært rusk i den tilberedte suspensjonen¹⁵. Suspensjoner av glial svulster utsatt for manuell mekanisk dissosiasjon alene hadde betydelig lavere celle levedyktighet enn behandlinger med dispase eller en kombinasjon av DNase, kollagenase og hyaluronidase¹⁵. Volovitz et al. anerkjente variasjonen i levedyktighet og kvalitet mellom de ulike metodene og understreket at utilstrekkelig dissosiasjon kan redusere nøyaktigheten av nedstrømsanalyse¹⁵.

I en egen studie sammenlignet forfatterne over 60 forskjellige metoder og kombinasjoner av dissosiasjon av dyrkede nevronceller¹⁴. Disse metodene inkluderte åtte forskjellige variasjoner av manuell mekanisk dissosiasjon ved pipettetrianturasjon, en sammenligning av inkubasjon med fem individuelle enzymer med tre forskjellige intervaller, og ulike kombinasjoner av mekanisk dissosiasjon med enzymatisk fordøyelse eller kombinasjonen av to enzymer¹⁴. Ingen av de mekaniske metodene ga en encellet suspensjon¹⁴. Fire av de enkle enzymbehandlingene, ti av kombinasjonen enzymatiske behandlinger og fire av kombinasjonene av mekanisk dissosiasjon med enzymatisk fordøyelse ga en encellet suspensjon¹⁴. Enzymatisk fordøyelse med TrypLE etterfulgt av Trypsin-EDTA dissosierte prøver¹⁴. For øvrig hadde prøver behandlet med TrypLE og/eller Trypsin-EDTA en tendens til å danne gelatinøse klumper¹⁴. Mens denne studien ble utført på dyrkede celler, snakker den til manglene ved pipettetrianturering eller enzymatisk fordøyelse alene.

Side-ved-side sammenligninger av manuell versus automatisert mekanisk dissosiasjon mangler. Imidlertid kjørte en gruppe flowcytometri for å sammenligne manuell og halvautomatisk mekanisk dissosiasjon av hele musehjerner i forbindelse med kommersiell papain eller trypsin enzymatisk dissosiasjonssett¹⁶. Behandling med dissosiatoren ga mer konsekvent levedyktige celler¹⁶. Etter dissosiasjon isolerte forfatterne også Prominin-1 celler, nevronale forløperceller og mikroglia¹⁶. For to av de tre isolerte cellepopulasjonene var renheten til de isolerte cellene litt høyere når prøver ble behandlet med dissociatoren, sammenlignet med manuelt¹⁶. Reiß et al. bemerket at person-til-person variabilitet i pipetteringsteknikk hindrer reproduserbarhet av levedyktig cellepopulasjonsutbytte i vevsdissosiasjon¹⁶. Forfatterne konkluderte med at automatisert mekanisk dissosiasjon standardiserer prøvebehandling¹⁶.

Metoden for dissosiasjon skissert i dette manuskriptet er en kombinasjon av helautomatisk mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse, ved hjelp av løsninger som følger med et kommersielt voksen hjernedissosiasjonssett¹⁷. I motsetning til standardprotokoller reduserer denne optimaliserte protokollen prøvemanipulering, gir en svært levedyktig encellet suspensjon, og er ment for behandling av minimale mengder startvev.