海馬は、1500年代にボローニャの解剖学者ジュリオ・チェーザレ・アランツィオによって最初に記述^{されました。}この新しく発見された構造に名前を付ける際に、アランツィオはおそらく 海馬¹属のタツノオトシゴとの奇妙な類似性に触発されました。海馬はストレス反応に関与していますが、学習と記憶におけるその役割で広く知られています。より具体的には、海馬は、宣言的および空間的記憶¹の符号化および検索を担当する。

海馬、または適切な海馬は、CA1(cornu ammonis)、CA2、およびCA3サブフィールド¹に分けられます。神経系の他の部分と比較して、海馬は、その可塑性および進行中の神経新生の可能性を含むいくつかのユニークな定義的特徴^{を有する2}。神経新生は、神経幹細胞の増殖および分化のプロセスであり、続いて既存のニューロンネットワークへの統合が続く。神経新生は、歯状回および側脳室(および嗅球)の脳室下帯の顆粒下帯に限定される³。神経新生は胚発生に豊富ですが、それは生涯にわたるプロセスです^3,4。したがって、この議論は海馬における成体の神経新生に焦点を当てる。

脳室下および顆粒下帯は、上衣細胞および血管細胞、ならびに神経幹細胞⁵の未熟および成熟系統を含む神経原性ニッチである。ミクログリアは、神経新生を調節する免疫細胞としてこれらのニッチに寄与する⁶。神経前駆細胞は、神経幹細胞⁷の非幹細胞後代である。脳室下帯には3種類の神経前駆細胞が存在する:放射状グリア様B型細胞、C型トランジット増幅前駆細胞、およびA型神経芽細胞^3、8。脳室下帯でゆっくりと分裂するB型神経前駆細胞は、急速に分裂するC型細胞⁸に分化することができる。続いて、C型細胞はA型細胞⁸に分化する。これらの神経芽細胞は、吻側移動流を通って嗅球に移動し、その後、介在ニューロンまたは希突起膠細胞に分化する⁹。これらの嗅球介在ニューロンは、嗅覚短期記憶、および連想学習の鍵であり、一方、希突起膠細胞は脳梁⁹の軸索を髄鞘化する。成体神経新生の大部分は、歯状回亜顆粒帯で起こり、そこでは放射状タイプ1および非放射状タイプ2の神経前駆細胞が見出される³。ほとんどの神経前駆細胞は、歯状顆粒ニューロンおよびアストロサイト¹⁰になる運命にある。ギャップ接合部によって接続されたアストロサイトは、可塑性、シナプス活性、およびニューロン興奮性を調節するためにネットワークを形成する⁵。歯状回の主要な興奮性ニューロンとして、顆粒細胞は嗅内皮質からCA3領域¹¹への入力を提供する。

神経幹細胞集団は、免疫磁気または免疫蛍光単離戦略を用いて単離することができる^12、13。神経組織は解離することが特に困難です。そのための努力は、しばしば、細胞生存率の低いサンプルおよび/または下流分析に必要な単一細胞懸濁液の製造に失敗する結果となる。神経解離は、機械的解離(フィルター、チョッピング技術、またはピペット粉砕の使用など)、酵素消化、または技術の組み合わせを介して行うことができる^14、15。神経解離法を評価する研究では、ピペット粉砕による手動機械的解離の生存率および品質を、ピペット粉砕および様々な酵素による消化の組み合わせと比較した¹⁵。品質は、調製した懸濁液¹⁵中の細胞凝集塊およびDNAまたは細胞内破片の量に基づいて等級付けした。単独で手動機械的解離を行ったグリア腫瘍の懸濁液は、ディスパーゼまたはDNase、コラゲナーゼ、およびヒアルロニダーゼの組み合わせによる処理よりも有意に低い細胞生存率を有していた¹⁵。Volovitzらは、異なる方法間の生存率および品質のばらつきを認め、不十分な解離が下流分析の精度を低下させる可能性があることを強調した¹⁵。

別の研究では、著者らは培養神経細胞の解離の60以上の異なる方法と組み合わせを比較した¹⁴。これらの方法には、ピペット粉砕による手動機械的解離の8つの異なるバリエーション、3つの異なる間隔での5つの個々の酵素とのインキュベーションの比較、および酵素消化による機械的解離の様々な組み合わせ、または2つの酵素の組み合わせ¹⁴が含まれていた。いずれの機械的方法も、単一細胞懸濁液¹⁴を生じた。4つの単一酵素処理、10の組合せ酵素処理、および4つの組合せの機械的解離と酵素消化は、単一細胞懸濁液¹⁴を得た。TrypLEによる酵素消化に続いてトリプシン−EDTAが最も効果的に解離したサンプル¹⁴。なお、TrypLEおよび/またはトリプシン-EDTAで処理した試料は、ゼラチン状凝集塊¹⁴を形成する傾向があった。この研究は培養細胞に対して実施されましたが、ピペットの粉砕または酵素消化のみの欠点を物語っています。

手動解離と自動機械的解離の並列比較は欠けている。しかしながら、1つのグループはフローサイトメトリーを実行して、市販のパパインまたはトリプシン酵素解離キット¹⁶と組み合わせてマウス脳全体の手動および半自動機械的解離を比較した。解離器による処理により、より一貫して生細胞¹⁶を得た。解離後、著者らはまた、プロミニン-1細胞、ニューロン前駆細胞、およびミクログリア¹⁶を単離した。3つの単離された細胞集団のうちの2つについて、単離された細胞の純度は、サンプルを解離剤で処理したとき、手動^の16と比較してわずかに高かった。Reißらは、ピペッティング技術における人的変動が、組織解離における生細胞集団収量の再現性を妨げることを指摘した¹⁶。著者らは、自動化された機械的解離がサンプル処理¹⁶を標準化すると結論付けた。

この原稿に概説されている解離の方法は、市販の成人脳解離キット¹⁷に付随する溶液を使用する、完全に自動化された機械的解離および酵素的消化の組み合わせである。標準的なプロトコルとは異なり、この最適化されたプロトコルは、サンプル操作を減らし、生存率の高い単一細胞懸濁液を生成し、最小限の開始組織を処理することを目的としています。