L’ippocampo fu descritto per la prima volta da un anatomista bolognese, Giulio Cesare Aranzio, nel 1500¹. Nel nominare questa nuova struttura, Aranzio è stato probabilmente ispirato dalla sua strana somiglianza con il cavalluccio marino del genere Hippocampus¹. L’ippocampo è coinvolto nelle risposte allo stress, ma è ampiamente noto per il suo ruolo nell’apprendimento e nella memoria. Più specificamente, l’ippocampo è responsabile della codifica e del recupero della memoria dichiarativa e spaziale¹.

L’ippocampo, o ippocampo vero e proprio, è diviso nei sottocampi CA1 (cornu ammonis), CA2 e CA3¹. Rispetto al resto del sistema nervoso, l’ippocampo ha diverse caratteristiche distintive uniche, tra cui la sua plasticità e il potenziale per la neurogenesi in corso². La neurogenesi è il processo di proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali, seguito dalla loro integrazione nella rete neuronale preesistente. La neurogenesi è limitata alla zona subgranulare del giro dentato e alla zona subventricolare dei ventricoli laterali (e dei bulbi olfattivi)³. Mentre la neurogenesi è abbondante nell’embriogenesi, è un processo permanente ^3,4. Come tale, questa discussione si concentrerà sulla neurogenesi adulta nell’ippocampo.

Le zone subventricolari e subgranulari sono nicchie neurogeniche contenenti cellule ependimali e vascolari, nonché lignaggi immaturi e maturi di cellule staminali neurali⁵. Le microglia contribuiscono a queste nicchie come cellule immunitarie per regolare la neurogenesi⁶. Le cellule progenitrici neurali sono progenie di cellule non staminali delle cellule staminali neurali⁷. Tre tipi di progenitori neurali sono presenti nella zona subventricolare: cellule radiali di tipo B simili a glia, progenitori di tipo C che amplificano il transito e neuroblasti di tipo A ^3,8. Le cellule progenitrici neurali di tipo B che si dividono lentamente nella zona subventricolare possono differenziarsi in cellule di tipo C⁸ che si dividono rapidamente. Successivamente, le cellule di tipo C si differenziano in cellule di tipo A⁸. Questi neuroblasti migrano attraverso il flusso migratorio rostrale verso il bulbo olfattivo prima di differenziarsi in interneuroni o oligodendrociti⁹. Questi interneuroni a bulbo olfattivo sono fondamentali per la memoria olfattiva a breve termine e l’apprendimento associativo, mentre gli oligodendrociti mielinano gli assoni del corpo calloso⁹. La maggior parte della neurogenesi adulta si verifica nella zona subgranulare del giro dentato, dove si trovano progenitori neurali radiali di tipo 1 e non radiali di tipo 2³. La maggior parte delle cellule progenitrici neurali sono destinate a diventare neuroni granulari dentati e astrociti¹⁰. Collegati da giunzioni gap, gli astrociti formano reti per modulare la plasticità, l’attività sinaptica e l’eccitabilità neuronale⁵. Come neurone eccitatorio primario del giro dentato, le cellule del granulo forniscono input dalla corteccia entorinale alla regione CA3¹¹.

Le popolazioni di cellule staminali neurali possono essere isolate utilizzando strategie di isolamento immunomagnetico o immunofluorescente^12,13. Il tessuto neurale è particolarmente difficile da dissociare; gli sforzi per farlo spesso si traducono in campioni con scarsa vitalità cellulare e/ o non riescono a produrre la necessaria sospensione unicellulare per l’analisi a valle. La dissociazione neurale può essere condotta tramite dissociazione meccanica (come l’uso di filtri, tecniche di taglio o triturazione di pipette), digestione enzimatica o una combinazione di tecniche^14,15. In uno studio che ha valutato i metodi di dissociazione neurale, sono state confrontate la vitalità e la qualità della dissociazione meccanica manuale mediante triturazione di pipette rispetto alle combinazioni di triturazione e digestione delle pipette con vari enzimi¹⁵. La qualità è stata classificata in base alla quantità di grumi cellulari e DNA o detriti subcellulari nella sospensione preparata¹⁵. Le sospensioni di tumori gliali sottoposti a dissociazione meccanica manuale da sole avevano una vitalità cellulare significativamente inferiore rispetto ai trattamenti con dispasi o una combinazione di DNasi, collagenasi e ialuronidasi¹⁵. Volovitz et al. hanno riconosciuto la variazione di vitalità e qualità tra i diversi metodi e hanno sottolineato che una dissociazione inadeguata può ridurre l’accuratezza dell’analisi a valle¹⁵.

In uno studio separato, gli autori hanno confrontato oltre 60 diversi metodi e combinazioni di dissociazione di cellule neuronali in coltura¹⁴. Questi metodi includevano otto diverse varianti di dissociazione meccanica manuale mediante triturazione a pipetta, un confronto dell’incubazione con cinque singoli enzimi a tre diversi intervalli e varie combinazioni di dissociazione meccanica con digestione enzimatica o la combinazione di due enzimi¹⁴. Nessuno dei metodi meccanici ha prodotto una sospensione a cella singola¹⁴. Quattro dei singoli trattamenti enzimatici, dieci dei trattamenti enzimatici combinati e quattro delle combinazioni di dissociazione meccanica con digestione enzimatica hanno prodotto una sospensione monocellulare¹⁴. Digestione enzimatica con TrypLE seguita da Campioni di Tripsina-EDTA più efficacemente dissociati¹⁴. Per inciso, i campioni trattati con TrypLE e/o Tripsina-EDTA tendevano a formare grumi gelatinosi¹⁴. Mentre questo studio è stato eseguito su cellule in coltura, parla delle carenze della triturazione della pipetta o della digestione enzimatica da sola.

Mancano confronti affiancati tra dissociazione meccanica manuale e automatica. Tuttavia, un gruppo ha eseguito la citometria a flusso per confrontare la dissociazione meccanica manuale e semi-automatizzata di interi cervelli di topo in combinazione con kit di dissociazione enzimatica commerciale di papaina o tripsina¹⁶. L’elaborazione con il dissociatore ha prodotto in modo più coerente cellule vitali¹⁶. A seguito della dissociazione, gli autori hanno anche isolato le cellule Prominin-1, le cellule precursori neuronali e la microglia¹⁶. Per due delle tre popolazioni cellulari isolate, la purezza delle cellule isolate era leggermente superiore quando i campioni venivano elaborati con il dissociatore, rispetto a¹⁶ manualmente. Reiß et al. hanno osservato che la variabilità da persona a persona nella tecnica di pipettaggio ostacola la riproducibilità della resa della popolazione cellulare vitale nella dissociazione dei tessuti¹⁶. Gli autori hanno concluso che la dissociazione meccanica automatizzata standardizza l’elaborazione dei campioni¹⁶.

Il metodo di dissociazione delineato in questo manoscritto è una combinazione di dissociazione meccanica completamente automatizzata e digestione enzimatica, utilizzando soluzioni che accompagnano un kit commerciale di dissociazione cerebrale per adulti¹⁷. A differenza dei protocolli standard, questo protocollo ottimizzato riduce la manipolazione del campione, produce una sospensione monocellulare altamente praticabile ed è destinato all’elaborazione di quantità minime di tessuto iniziale.