L’hippocampe a été décrit pour la première fois par un anatomiste bolognais, Giulio Cesare Aranzio, dans les années 1500¹. En nommant cette nouvelle structure, Aranzio s’est probablement inspiré de sa ressemblance étrange avec l’hippocampe du genre Hippocampe¹. L’hippocampe est impliqué dans les réponses au stress, mais est largement connu pour son rôle dans l’apprentissage et la mémoire. Plus précisément, l’hippocampe est responsable de l’encodage et de la récupération de la mémoire déclarative et spatiale¹.

L’hippocampe, ou hippocampe proprement dit, est divisé en sous-champs CA1 (cornu ammonis), CA2 et CA3¹. Comparé au reste du système nerveux, l’hippocampe présente plusieurs caractéristiques déterminantes uniques, notamment sa plasticité et son potentiel de neurogenèse en cours². La neurogenèse est le processus de prolifération et de différenciation des cellules souches neurales, suivi de leur intégration dans le réseau neuronal préexistant. La neurogenèse est limitée à la zone sous-granulaire du gyrus denté et à la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux (et des bulbes olfactifs)³. Bien que la neurogenèse soit abondante dans l’embryogenèse, il s’agit d’un processus qui dure toute la vie ^3,4. En tant que tel, cette discussion se concentrera sur la neurogenèse adulte dans l’hippocampe.

Les zones sous-ventriculaires et sous-granulaires sont des niches neurogènes contenant des cellules épendymaires et vasculaires, ainsi que des lignées immatures et matures de cellules souches neurales⁵. Les microglies contribuent à ces niches en tant que cellules immunitaires pour réguler la neurogenèse⁶. Les cellules progénitrices neurales sont des descendants de cellules souches neurales⁷. Trois types de progéniteurs neuronaux sont présents dans la zone sous-ventriculaire : les cellules radiales de type B de type glie, les progéniteurs amplificateurs de transit de type C et les neuroblastes de type A ^3,8. Les cellules progénitrices neurales de type B qui se divisent lentement dans la zone sous-ventriculaire peuvent se différencier en cellules de type C⁸ qui se divisent rapidement. Par la suite, les cellules de type C se différencient en cellules de type A⁸. Ces neuroblastes migrent à travers le flux migratoire rostral vers le bulbe olfactif avant de se différencier en interneurones ou oligodendrocytes⁹. Ces interneurones du bulbe olfactif sont la clé de la mémoire olfactive à court terme et de l’apprentissage associatif, tandis que les oligodendrocytes myélisent les axones du corps calleux⁹. La majorité de la neurogenèse adulte se produit dans la zone sous-granulaire du gyrus denté, où se trouvent les progéniteurs neuronaux radiaux de type 1 et non radicaux de type 2³. La plupart des cellules progénitrices neurales sont destinées à devenir des neurones granulaires dentés et des astrocytes¹⁰. Reliés par des jonctions lacunaires, les astrocytes forment des réseaux pour moduler la plasticité, l’activité synaptique et l’excitabilité neuronale⁵. En tant que neurone excitateur primaire du gyrus denté, les cellules granulaires fournissent une entrée du cortex entorhinal à la région CA3¹¹.

Les populations de cellules souches neurales peuvent être isolées à l’aide de stratégies d’isolement immunomagnétiques ou immunofluorescentes^12,13. Le tissu neural est particulièrement difficile à dissocier; les efforts déployés pour ce faire aboutissent souvent à des échantillons dont la viabilité cellulaire est médiocre et/ou ne parviennent pas à produire la suspension unicellulaire nécessaire pour l’analyse en aval. La dissociation neuronale peut être réalisée par dissociation mécanique (comme l’utilisation de filtres, de techniques de hachage ou de trituration par pipette), la digestion enzymatique ou une combinaison de techniques^14,15. Dans une étude évaluant les méthodes de dissociation neuronale, la viabilité et la qualité de la dissociation mécanique manuelle par trituration pipette par rapport aux combinaisons de trituration pipette et de digestion avec diverses enzymes ont été comparées¹⁵. La qualité a été classée en fonction de la quantité d’amas cellulaires et d’ADN ou de débris subcellulaires dans la suspension préparée¹⁵. Les suspensions de tumeurs gliales soumises à une dissociation mécanique manuelle seule avaient une viabilité cellulaire significativement plus faible que les traitements par dispase ou une combinaison de DNase, de collagénase et de hyaluronidase¹⁵. Volovitz et coll. ont reconnu la variation de la viabilité et de la qualité entre les différentes méthodes et ont souligné qu’une dissociation inadéquate peut réduire la précision de l’analyse en aval¹⁵.

Dans une étude distincte, les auteurs ont comparé plus de 60 méthodes et combinaisons différentes de dissociation de cellules neuronales cultivées¹⁴. Ces méthodes comprenaient huit variantes différentes de la dissociation mécanique manuelle par trituration pipette, une comparaison de l’incubation avec cinq enzymes individuelles à trois intervalles différents et diverses combinaisons de dissociation mécanique avec digestion enzymatique ou combinaison de deux enzymes¹⁴. Aucune des méthodes mécaniques n’a donné une suspension monocellulaire¹⁴. Quatre des traitements enzymatiques simples, dix des traitements enzymatiques combinés et quatre des combinaisons de dissociation mécanique avec digestion enzymatique ont donné une suspension unicellulaire¹⁴. La digestion enzymatique avec TrypLE suivie de Trypsine-EDTA a le plus efficacement dissocié les échantillons¹⁴. Incidemment, les échantillons traités avec du TrypLE et/ou de la Trypsine-EDTA avaient tendance à former des amas gélatineux¹⁴. Bien que cette étude ait été réalisée sur des cellules cultivées, elle parle des lacunes de la trituration pipette ou de la digestion enzymatique seule.

Les comparaisons côte à côte de la dissociation mécanique manuelle et automatisée font défaut. Cependant, un groupe a effectué une cytométrie en flux pour comparer la dissociation mécanique manuelle et semi-automatisée de cerveaux entiers de souris en conjonction avec des kits commerciaux de dissociation enzymatique de papaïne ou de trypsine¹⁶. Le traitement avec le dissociateur a donné des cellules viables de manière plus cohérente¹⁶. Après la dissociation, les auteurs ont également isolé des cellules Prominin-1, des cellules précurseurs neuronales et des microglies¹⁶. Pour deux des trois populations de cellules isolées, la pureté des cellules isolées était légèrement plus élevée lorsque les échantillons étaient traités avec le dissociateur, par rapport à¹⁶ manuellement. Reiß et al. ont noté que la variabilité d’une personne à l’autre dans la technique de pipetage entrave la reproductibilité du rendement viable de la population cellulaire dans la dissociation tissulaire¹⁶. Les auteurs ont conclu que la dissociation mécanique automatisée normalise le traitement des échantillons¹⁶.

La méthode de dissociation décrite dans ce manuscrit est une combinaison de dissociation mécanique entièrement automatisée et de digestion enzymatique, en utilisant des solutions accompagnant un kit commercial de dissociation cérébrale adulte¹⁷. Contrairement aux protocoles standard, ce protocole optimisé réduit la manipulation des échantillons, produit une suspension unicellulaire hautement viable et est destiné au traitement de quantités minimales de tissu de départ.