De hippocampus werd voor het eerst beschreven door een Bolognese anatoom, Giulio Cesare Aranzio, in de jaren 1500¹. Bij het benoemen van deze nieuw ontdekte structuur werd Aranzio waarschijnlijk geïnspireerd door de griezelige gelijkenis met het zeepaardje van het geslacht Hippocampus¹. De hippocampus is betrokken bij stressreacties, maar staat algemeen bekend om zijn rol in leren en geheugen. Meer specifiek is de hippocampus verantwoordelijk voor het coderen en ophalen van declaratief en ruimtelijk geheugen¹.

De hippocampus, of eigenlijke hippocampus, is verdeeld in de SUBVELDEN CA1 (cornu ammonis), CA2 en CA3^. In vergelijking met de rest van het zenuwstelsel heeft de hippocampus verschillende unieke bepalende kenmerken, waaronder de plasticiteit en het potentieel voor voortdurende neurogenese². Neurogenese is het proces van de proliferatie en differentiatie van neurale stamcellen, gevolgd door hun integratie in het reeds bestaande neuronale netwerk. Neurogenese is beperkt tot de subgranulaire zone van de gyrus dentate en de subventriculaire zone van de laterale ventrikels (en de olfactorische bollen)³. Hoewel neurogenese overvloedig aanwezig is in embryogenese, is het een levenslang proces ^3,4. Als zodanig zal deze discussie zich richten op volwassen neurogenese in de hippocampus.

De subventriculaire en subgranulaire zones zijn neurogene niches die ependymale en vasculaire cellen bevatten, evenals onrijpe en volwassen afstammingslijnen van neurale stamcellen⁵. Microglia dragen bij aan deze niches als immuuncellen om neurogenese te reguleren⁶. Neurale voorlopercellen zijn niet-stamcelprogenieën van neurale stamcellen⁷. Drie soorten neurale voorlopers zijn aanwezig in de subventriculaire zone: radiale glia-achtige type B-cellen, type C transit-versterkende voorlopers en type A neuroblasten ^3,8. De langzaam delende type B neurale voorlopercellen in de subventriculaire zone kunnen differentiëren in snel delende type C-cellen⁸. Vervolgens differentiëren type C-cellen in type A-cellen⁸. Deze neuroblasten migreren door de rostrale migratiestroom naar de bulbus olfactorius voordat ze differentiëren in interneuronen of oligodendrocyten⁹. Deze olfactorische bolintercurnen zijn de sleutel tot olfactorisch kortetermijngeheugen en associatief leren, terwijl de oligodendrocyten myelinaat axonen van het corpus callosum⁹. De meerderheid van de volwassen neurogenese vindt plaats in de subgranulaire zone van de gyrus dentate, waar radiale type 1 en niet-radiale type 2 neurale voorlopers worden gevonden³. De meeste neurale voorlopercellen zijn voorbestemd om dentate granulaatneuronen en astrocyten¹⁰ te worden. Verbonden door gap junctions, vormen astrocyten netwerken om plasticiteit, synaptische activiteit en neuronale prikkelbaarheid te moduleren⁵. Als het primaire exciterende neuron van de gyrus dentate leveren korrelcellen input van de entorhinale cortex naar het CA3-gebied¹¹.

Neurale stamcelpopulaties kunnen worden geïsoleerd met behulp van immunomagnetische of immunofluorescente isolatiestrategieën^12,13. Neuraal weefsel is bijzonder moeilijk te dissociëren; pogingen om dit te doen resulteren vaak in monsters met een slechte levensvatbaarheid van de cel en/ of het niet produceren van de noodzakelijke eencellige suspensie voor downstream-analyse. Neurale dissociatie kan worden uitgevoerd via mechanische dissociatie (zoals het gebruik van filters, haktechnieken of pipettrituratie), enzymatische spijsvertering of een combinatie van technieken^14,15. In een studie die neurale dissociatiemethoden evalueerde, werden de levensvatbaarheid en kwaliteit van handmatige mechanische dissociatie door pipettrituratie versus combinaties van pipettrituratie en spijsvertering met verschillende enzymen vergeleken¹⁵. De kwaliteit werd beoordeeld op basis van de hoeveelheid celklonten en DNA of subcellulair puin in de bereide suspensie¹⁵. Suspensies van gliale tumoren onderworpen aan handmatige mechanische dissociatie alleen hadden een significant lagere cel levensvatbaarheid dan behandelingen met dispase of een combinatie van DNase, collagenase en hyaluronidase¹⁵. Volovitz et al. erkenden de variatie in levensvatbaarheid en kwaliteit tussen de verschillende methoden en benadrukten dat onvoldoende dissociatie de nauwkeurigheid van downstream-analyse kan verminderen¹⁵.

In een afzonderlijke studie vergeleken de auteurs meer dan 60 verschillende methoden en combinaties van dissociatie van gekweekte neuronale cellen¹⁴. Deze methoden omvatten acht verschillende variaties van handmatige mechanische dissociatie door pipettrituratie, een vergelijking van incubatie met vijf individuele enzymen met drie verschillende intervallen en verschillende combinaties van mechanische dissociatie met enzymatische spijsvertering of de combinatie van twee enzymen¹⁴. Geen van de mechanische methoden leverde een eencellige suspensie^{op 14}. Vier van de enkelvoudige enzymbehandelingen, tien van de combinatie-enzymatische behandelingen en vier van de combinaties van mechanische dissociatie met enzymatische vertering leverden een eencellige suspensie op¹⁴. Enzymatische vertering met TrypLE gevolgd door Trypsine-EDTA meest effectief gedissocieerde monsters¹⁴. Overigens hadden monsters behandeld met TrypLE en/of Trypsine-EDTA de neiging gelatineuze klonten^{te vormen 14}. Hoewel deze studie werd uitgevoerd op gekweekte cellen, spreekt het over de tekortkomingen van pipettrituratie of enzymatische spijsvertering alleen.

Zij-aan-zij vergelijkingen van handmatige versus geautomatiseerde mechanische dissociatie ontbreken. Eén groep voerde echter flowcytometrie uit om handmatige en semi-geautomatiseerde mechanische dissociatie van hele muizenhersenen te vergelijken in combinatie met commerciële papaïne- of trypsine-enzymatische dissociatiekits¹⁶. Verwerking met de dissociator leverde consistenter levensvatbare cellen op¹⁶. Na dissociatie isoleerden de auteurs ook Prominine-1-cellen, neuronale voorlopercellen en microglia¹⁶. Voor twee van de drie geïsoleerde celpopulaties was de zuiverheid van de geïsoleerde cellen iets hoger wanneer monsters werden verwerkt met de dissociator, in vergelijking met handmatig¹⁶. Reiß et al. merkten op dat person-to-person variabiliteit in pipetteertechniek de reproduceerbaarheid van levensvatbare celpopulatieopbrengst in weefseldissociatie belemmert¹⁶. De auteurs concludeerden dat geautomatiseerde mechanische dissociatie de monsterverwerking standaardiseert¹⁶.

De methode van dissociatie die in dit manuscript wordt beschreven, is een combinatie van volledig geautomatiseerde mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering, met behulp van oplossingen die gepaard gaan met een commerciële hersendissociatiekit voor volwassenen¹⁷. In tegenstelling tot standaardprotocollen vermindert dit geoptimaliseerde protocol monstermanipulatie, levert het een zeer levensvatbare eencellige suspensie op en is het bedoeld voor het verwerken van minimale hoeveelheden startweefsel.