الجمع بين التفكك الميكانيكي والأنزيمي لأنسجة الحصين في دماغ الفئران
Summary
بروتوكول تفكك الخلايا العصبية هذا مخصص للعينات التي تحتوي على كمية منخفضة من المواد الأولية وينتج عنه تعليق أحادي الخلية قابل للتطبيق للغاية للتحليل النهائي ، مع خطوات تثبيت وتلطيخ اختيارية.
Abstract
يعمل بروتوكول التفكك العصبي هذا (وهو تكييف للبروتوكول المصاحب لمجموعة تفكيك دماغية تجارية للبالغين) على تحسين معالجة الأنسجة استعدادا للتحليل التفصيلي في المراحل النهائية مثل قياس التدفق الخلوي أو تسلسل الخلية الواحدة. يمكن إجراء التفكك العصبي عن طريق التفكك الميكانيكي (مثل استخدام المرشحات أو تقنيات التقطيع أو تريتوريون الماصة) أو الهضم الأنزيمي أو مزيج منهما. يمكن للطبيعة الحساسة للخلايا العصبية أن تعقد الجهود المبذولة للحصول على تعليق خلية واحدة حقيقي وقابل للتطبيق للغاية مع الحد الأدنى من الحطام الخلوي المطلوب لتحليل الخلية الواحدة. تظهر البيانات أن هذا المزيج من التفكك الميكانيكي الآلي والهضم الأنزيمي ينتج باستمرار تعليقا أحادي الخلية قابلا للتطبيق (>90٪) ، متغلبا على الصعوبات المذكورة أعلاه. في حين أن بعض الخطوات تتطلب براعة يدوية، فإن هذه الخطوات تقلل من معالجة العينات وفقدان الخلايا المحتمل. تفصل هذه المخطوطة كل خطوة من خطوات العملية لتجهيز مختبرات أخرى لفصل كميات صغيرة من الأنسجة العصبية بنجاح استعدادا للتحليل النهائي.
Introduction
تم وصف الحصين لأول مرة من قبل عالم التشريح البولونزي ، جوليو سيزار أرانزيو ، في 15001. في تسمية هذا الهيكل المكتشف حديثا ، من المحتمل أن يكون أرانزيو مستوحى من تشابهه الغريب مع فرس البحر من جنس Hippocampus1. يشارك الحصين في استجابات الإجهاد ولكنه معروف على نطاق واسع بدوره في التعلم والذاكرة. وبشكل أكثر تحديدا ، فإن الحصين مسؤول عن تشفير واسترجاع الذاكرة التقريرية والمكانية1.
ينقسم الحصين ، أو الحصين المناسب ، إلى CA1 (أمونيات القرنو) ، CA2 ، و CA3 الفرعية1. بالمقارنة مع بقية الجهاز العصبي ، فإن الحصين له العديد من الخصائص المميزة الفريدة ، بما في ذلك اللدونة وإمكانية تكوين الخلايا العصبية المستمرة2. تكوين الخلايا العصبية هو عملية انتشار وتمايز الخلايا الجذعية العصبية ، تليها اندماجها في الشبكة العصبية الموجودة مسبقا. يقتصر تكوين الخلايا العصبية على المنطقة تحت الحبيبية للتلفيف المسنن والمنطقة تحت البطينية للبطينين الجانبيين (والمصابيح الشمية)3. في حين أن تكوين الخلايا العصبية وفير في التكوين الجنيني ، إلا أنها عملية تستمر مدى الحياة 3,4. على هذا النحو ، ستركز هذه المناقشة على تكوين الخلايا العصبية للبالغين في الحصين.
المناطق تحت البطينية وتحت الحبيبية هي منافذ عصبية المنشأ تحتوي على خلايا إسندية ووعائية ، بالإضافة إلى سلالات غير ناضجة وناضجة من الخلايا الجذعية العصبية5. تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة في هذه المنافذ كخلايا مناعية لتنظيم تكوين الخلايا العصبية6. الخلايا السلفية العصبية هي ذرية الخلايا غير الجذعية للخلايا الجذعية العصبية7. توجد ثلاثة أنواع من السلف العصبي في المنطقة تحت البطينية: الخلايا البائية الشبيهة بالدبقية الشعاعية ، والأسلاف المضخمين للعبور من النوع C ، والخلايا العصبية من النوع A 3,8. يمكن للخلايا السلفية العصبية من النوع B التي تنقسم ببطء في المنطقة تحت البطينية أن تتمايز إلى خلايا من النوع C سريعة الانقسام8. في وقت لاحق ، تتمايز خلايا النوع C إلى خلايا من النوع A8. تهاجر هذه الأرومات العصبية عبر تيار هجرة السطح إلى المصباح الشمي قبل أن تتمايز إلى الخلايا العصبية الداخلية أو الخلايا قليلة التغصن9. هذه الخلايا العصبية الداخلية للبصيلات الشمية هي مفتاح الذاكرة الشمية قصيرة المدى ، والتعلم الترابطي ، في حين أن الخلايا الأحادية التغصن الميالينات محاور الجسم الثفني9. تحدث غالبية تكوين الخلايا العصبية لدى البالغين في المنطقة تحت الحبيبية من التلفيف المسنن ، حيث تم العثور على السلف العصبي الشعاعي من النوع 1 وغير الشعاعي من النوع 23. معظم الخلايا السلفية العصبية مقدر لها أن تصبح خلايا عصبية حبيبية مسننة وخلايا نجمية10. متصلة بواسطة تقاطعات الفجوة ، تشكل الخلايا النجمية شبكات لتعديل اللدونة والنشاط المشبكي واستثارة الخلايا العصبية5. باعتبارها الخلية العصبية المثيرة الأولية للتلفيف المسنن ، توفر الخلايا الحبيبية مدخلات من القشرة الداخلية إلى منطقة CA311.
يمكن عزل مجموعات الخلايا الجذعية العصبية باستخدام استراتيجيات العزل المناعية أو المناعية الفلورية12,13. الأنسجة العصبية يصعب فصلها بشكل خاص. غالبا ما تؤدي الجهود المبذولة للقيام بذلك إلى عينات ذات قابلية ضعيفة للخلية و / أو تفشل في إنتاج تعليق الخلية الواحدة الضروري للتحليل النهائي. يمكن إجراء التفكك العصبي عن طريق التفكك الميكانيكي (مثل استخدام المرشحات أو تقنيات التقطيع أو التحلل الماصي) أو الهضم الأنزيمي أو مزيج من التقنيات14,15. في دراسة لتقييم طرق التفكك العصبي ، تمت مقارنة جدوى وجودة التفكك الميكانيكي اليدوي عن طريق التفكك الميكانيكي للماصة مقابل مجموعات من التقطيع والهضم مع الإنزيمات المختلفة15. تم تصنيف الجودة بناء على كمية كتل الخلايا والحمض النووي أو الحطام دون الخلوي في التعليق المعد15. كان لتعليق الأورام الدبقية الخاضعة للتفكك الميكانيكي اليدوي وحده صلاحية خلوية أقل بكثير من العلاجات التي تحتوي على dispase أو مزيج من DNase و collagenase و hyaluronidase15. وأقر فولوفيتز وآخرون بالتباين في الجدوى والجودة بين الأساليب المختلفة وشددوا على أن عدم كفاية التفكك قد يقلل من دقة التحليل النهائي15.
في دراسة منفصلة ، قارن المؤلفون أكثر من 60 طريقة ومجموعات مختلفة من تفكك الخلايا العصبية المستزرعة14. وشملت هذه الطرق ثمانية أشكال مختلفة من التفكك الميكانيكي اليدوي عن طريق التحلل الماصة، ومقارنة الحضانة مع خمسة إنزيمات فردية على ثلاث فترات مختلفة، ومجموعات مختلفة من التفكك الميكانيكي مع الهضم الأنزيمي أو مزيج من اثنين من الإنزيمات14. لم تسفر أي من الطرق الميكانيكية عن تعليق أحادي الخلية14. أربعة من العلاجات بالإنزيم الواحد ، وعشرة من العلاجات الأنزيمية المركبة ، وأربعة من مجموعات التفكك الميكانيكي مع الهضم الأنزيمي أسفرت عن تعليق خلية واحدة14. الهضم الأنزيمي مع التربيل تليها التربسين-EDTA العينات المنفصلة بشكل فعال14. وبالمناسبة، تميل العينات المعالجة بالتريب و/أو التربسين-EDTA إلى تكوين كتل جيلاتينية14. في حين أجريت هذه الدراسة على الخلايا المستزرعة ، إلا أنها تتحدث عن أوجه القصور في تريتور الماصة أو الهضم الأنزيمي وحده.
لا توجد مقارنات جنبا إلى جنب بين التفكك اليدوي والميكانيكي الآلي. ومع ذلك ، أجرت مجموعة واحدة قياس التدفق الخلوي لمقارنة التفكك الميكانيكي اليدوي وشبه الآلي لأدمغة الفئران بأكملها بالتزامن مع مجموعات التفكك الأنزيمي التجاري أو التربسين16. أسفرت المعالجة باستخدام الفاصل بشكل أكثر اتساقا عن خلايا قابلة للحياة16. بعد الانفصال ، قام المؤلفون أيضا بعزل خلايا Prominin-1 ، وخلايا السلائف العصبية ، والخلايا الدبقية الصغيرة16. بالنسبة لاثنين من مجموعات الخلايا المعزولة الثلاث ، كانت نقاء الخلايا المعزولة أعلى قليلا عندما تمت معالجة العينات باستخدام المنفصل ، مقارنة ب16 يدويا. لاحظ ريس وآخرون أن التباين من شخص لآخر في تقنية السحب يعوق تكرار غلة الخلايا القابلة للحياة في تفكك الأنسجة16. خلص المؤلفون إلى أن التفكك الميكانيكي الآلي يوحد معالجة العينات16.
طريقة التفكك الموضحة في هذه المخطوطة هي مزيج من التفكك الميكانيكي الآلي بالكامل والهضم الأنزيمي، باستخدام حلول مصاحبة لمجموعة تجارية لتفكك الدماغ للبالغين17. على عكس البروتوكولات القياسية ، يقلل هذا البروتوكول المحسن من معالجة العينات ، وينتج عنه تعليق أحادي الخلية قابل للتطبيق للغاية ، ويهدف إلى معالجة الحد الأدنى من كميات الأنسجة الأولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتطلب عدة خطوات في بروتوكول التفكك العصبي هذا تقنية بارعة وبراعة – تروية ، وطموح فائق ، وإزالة المايلين. طوال عملية التروية ، يجب أن تظل الأعضاء الداخلية سليمة (بصرف النظر عن إزالة الحجاب الحاجز وقطع القلب) ؛ وهذا يشمل تجنب الغرف العلوية للقلب باستخدام إبرة الفراشة. في حين أن كمية المياه ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر إيمي روجرز على توفير التدريب العملي والدعم المستمر للمنتجات. نشكر الدكتورة أماندا بيرك على استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتوضيح المناقشات المستمرة. نشكر ميريديث جوهايم ومجموعة UAMS Science Communication Group على التحرير النحوي والتنسيق لهذه المخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R25GM083247 و NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
Referências
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O’Keefe, J. . The Hippocampus Book. , (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).
- Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
- Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
- Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
- Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
- Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
- Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
- Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, 137-145 (2015).
- Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
- Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020)
- Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021)
- Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
- Recommended controls for flow cytometry. Abcam Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021)
- . Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021)
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
- Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
- Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
- O’Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).
