전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

여기에 설명된 프로토콜은 매디슨 위스콘신 대학의 라이트 연구소와 Cryo-EM 연구 센터에서 사용하는 세포 배양, 마이크로 패턴 및 이미징 방법의 편집입니다. 워크플로는 그림 1에 표시됩니다. 추가 교육 및 교육 자료는 다음 사이트에서 사용할 수 있습니다: https://cryoem.wisc.edu 또는 https://wrightlab.wisc.edu 1. 패터닝을 위한 그리드 준비 TEM 그리드를 깨끗한 유리 슬라이드로 옮기고, 탄소 측위로 (탄소 호일의 표준 두께는 12 nm입니다). 탄소 증발기인 ACE600을 사용하여 5-8nm의 추가 탄소를 그리드에 증발하여 전체 탄소 필름 내구성을 향상시춥니다.참고: SiO2 그리드에는 이 단계가 필요하지 않습니다. 이 단계는 사전에 수행 될 수있다; 진공 건조기와 같은 습도가 낮은 환경에 코팅된 그리드를 저장합니다. 그리드 준비 홀더로 그리드를 전송하고 광채 배출 그리드 탄소 측위로. 글로우 방전 시스템을 사용하여 10mA에서 60s의 그리드를 배출하며 80mm 작동 거리와 1.0 x 10-3 mbar의 진공 압력으로 그리드를 배출합니다. 다음 단계의 15-30 분 이내에이 작업을 수행하십시오.참고: 그리드 준비 홀더는 작은 페트리 접시에 필터 종이 조각으로 상업적으로 구입하거나 수제 할 수 있습니다. 2. 안티 파울 링 층의 응용 프로그램 참고: 그리드를 처리할 때 적절한 멸균 기술을 사용해야 하며 모든 솔루션은 멸균 및/또는 필터 를 살균해야 합니다. 그리드(카본 사이드 업)를 깨끗한 유리 슬라이드 또는 커버슬립으로 옮기고 그리드 간에 최소 1cm의 분리를 합니다. 파이펫 10 μL000% 폴리-L-리신(PLL)을 각 그리드에 올보고 있습니다. 촉촉한 종이 타월이 있는 밀폐된 플라스틱 상자와 같이 습한 챔버에서 그리드를 최소 30분 동안 배양합니다.참고: 이 단계는 하룻밤 사이에 연장할 수 있습니다. 챔버의 습도 수준이 그리드가 건조되는 것을 방지하기에 충분해야 합니다. 0.1 M HEPES pH 8.5의 15 μL로 각 그리드를 세 번 세척합니다. 각 세척에 대해 그리드를 건조시키지 않고 파이펫으로 그리드에서 대부분의 액체를 제거합니다. 신선한 버퍼 15 μL을 추가하고 적어도 30 s에 대한 배양하고 반복합니다. 최종 세척 후 각 그리드를 0.1 M HEPES의 15 μL에 둡니다.참고: 이 단계와 향후 단계에서는 그리드를 적시게 하고 파이펫과 그리드 간의 접촉을 방지하는 것이 중요합니다. 각 그리드당 100 mg/mL 폴리에틸렌 글리콜-수치니미딜 발레염(PEG-SVA)의 10μL을 0.1M HEPES pH 8.5로 준비한다. PEG-SVA는 부드러운 혼합으로 빠르게 녹아 선명한 솔루션을 제공합니다.참고: PEG-SVA 솔루션을 미리 준비하지 마십시오. PEG-SVA는 pH 8.5에서 10분의 반감기를 가지고 있습니다. -20°C의 건조기 또는 건조한 환경에 저장하여 PEG-SVA 스톡을 과도한 수분에 노출시키고 개봉 전에 실온으로 따뜻하게 하는 것을 피하십시오. PEG-SVA 용액을 준비한 직후 각 그리드에서 HEPES pH 8.5의 15 μL 낙하를 제거하고 PEG-SVA 용액의 10 μL 낙하를 추가합니다. 개습 챔버에서 그리드를 적어도 1 시간 동안 배양합니다.참고: 이 단계는 하룻밤 사이에 연장할 수 있습니다. 챔버의 습도가 그리드가 건조되는 것을 방지하기에 충분해야 합니다. 멸균 수의 15 μL로 각 그리드를 세 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 그리드건조하지 않고 파이펫으로 그리드에서 액체의 대부분을 제거하고, 담수 의 15 μL을 추가하고, 적어도 30 s에 대한 배양하고 반복합니다. 마지막 세척 후 각 그리드를 15 μL의 물에 둡니다. 3. PLPP 젤 을 적용 각 그리드에 대해 깨끗한 현미경 커버슬립을 준비합니다. 각 그리드에 대해 다음 단계를 완료하여 한 번에 하나의 그리드를 사용하여 그리드가 건조될 가능성을 최소화합니다. 커버슬립 중앙에 1.0 μL 방울의 물을 놓아 그리드를 커버슬립에 배치하고 그리드를 적시게 합니다. 15 μL 물 방울에서 덮개 슬립의 1.0 μL 물 방울로 그리드를 조심스럽게 이송합니다. 그리드 탄소 면을 위로 올려 놓으십시오. 그리드 위에 폴리디메틸실록산(PDMS) 스텐실을 조심스럽게 배치하여 그리드를 중심으로 유지하고 그리드의 탄소 호일과스텐실 접촉을 최소화합니다. 그리드에 4-벤조일벤질 트리메틸람모늄(PLPP) 젤의 1.0 μL을 넣습니다. 파이펫을 부드럽게 섞어줍니다(파이펫 팁으로 그리드를 만지지 않음). 그리드가 있는 커버슬립을 어두운 위치로 이동하여 건조시다. 젤은 약 15-30 분 안에 건조합니다. 4. 마이크로 패턴의 교정 및 설계 하이라이터가 있는 유리 커버슬립의 한쪽에 색을 새는 다. 미세 기울어진 영구 마커에서 검은색 선을 추가하여 초점을 쉽게 맞출 수 있습니다. 컬러 측이 객관적인 렌즈를 향할 수 있도록 현미경에 커버슬립을 놓습니다. 브라이트필드 모드를 사용하여 형광펜에 초점을 맞춥니다. 현미경과 마이크로 패턴 시스템이 켜져 있는지 확인하고 올바른 조명 경로가 설정됩니다. 마이크로스코프 컴퓨터에서 마이크로매니저와 레오나르도 소프트웨어(플러그인 > 레오나르도)를 엽니다. 보정을 선택하고 화면 의 지침을 따릅니다. 슬라이드에 투사된 이미지가 초점에 초점을 맞추도록 현미경 포커스를 조정합니다. 노출 시간을 줄여야 할 수도 있습니다. 교정 후 지금 패턴을 선택합니다. 프로그램의 왼쪽 상단 창에서 교정 데이터 아래에 보고된 마이크로미터/픽셀(μm/px) 비율을 기록합니다(그림 2, 영역 1). 이 비율을 사용하여 패턴을 디자인할 때 마이크로미터당 사용할 픽셀 수를 결정합니다. 교정 후, 소프트웨어가 현미경에서 라이브 밝은 필드 보기와 함께 열려 있는지 확인합니다. 준비된 그리드를 커버슬립(섹션 3)에 적재하여 그리드가 목표 렌즈를 향하도록 무대에 로드합니다. 스테이지를 배치하고 포커스를 조정하여 그리드가 소프트웨어 창에 표시되도록 합니다. 마이크로미터에서 그리드 사각형 및 그리드 막대의 크기를 측정합니다. 이 소프트웨어에는 그리드를 측정하기 위해 왼쪽 아래 모서리 근처의 버튼에 의해 활성화된 눈금표가 포함되어 있습니다(그림 2, 영역 2). 예를 들어, 200 메쉬 그리드에 사용되는 패턴은 ~87× 87 μm 그리드 사각형 및 ~36 μm 그리드 막대에 해당한다.참고: 이 소프트웨어는 즉석에서 패턴을 크기 조정하는 유연성을 제공하므로 측정에 사소한 부정확성이 허용될 수 있습니다. 위의 측정 값과 비율을 기반으로 이미지 생성 소프트웨어로 패턴을 만듭니다. 20× 목표가 있는 최소 피쳐 크기는 1.2 μm입니다. 패턴은 압축되지 않은 8비트 .tiff 파일로 저장되어야 합니다. 소프트웨어를 저장할 때 이미지를 다른 픽셀 크기로 다시 조정하지 않도록 합니다. 패턴은 800 × 800 픽셀 상자 내에 맞아야 하며, 4개의 그리드 사각형을 덮기에 충분합니다.참고: 255(흰색)의 값을 가진 픽셀은 가장 높은 강도(레이저의 총 용량)로 패턴화되고 값이 0(검정)인 픽셀은 패턴화되지 않습니다. 중간 값을 가진 모든 픽셀은 약 (X/255)*총 용량의 용량으로 패턴화됩니다. 그림 3A에서 255 및 129의 픽셀 값이 그레이스케일 패턴에 사용되었습니다. 패턴이 디자인되면 수정없이 저장하고 다시 사용할 수 있습니다. 5. 마이크로 패턴화 교정 후, 소프트웨어가 현미경에서 라이브 밝은 필드 보기와 함께 열려 있는지 확인합니다. 준비된 그리드를 커버슬립(섹션 3)에 적재하여 그리드가 목표 렌즈를 향하도록 무대에 로드합니다. 스테이지를 배치하고 포커스를 조정하여 소프트웨어의 그리드를 볼 수 있습니다. 초기 실행의 경우 새 템플릿을 디자인합니다. 소프트웨어에서 ROI 추가 ( 그림 2 영역 3의 위치에 표시되지 않음)를 선택하고 3,000 μm 원을 선택합니다. 화면의 밝은 필드 이미지를 사용하여 그리드 위에 원 ROI를 배치합니다. ROI를 고정하려면 잠금 장치를 누릅니다. ROI를 제자리에 고정한 후 패턴 추가 를 선택합니다( 그림 2 영역 3의 위치에 표시되지 않음). 섹션 4에서 디자인 된 패턴을 선택합니다. 그리드를 6개 영역으로 나누어 각 지역의 독립적인 초점 과 포지셔닝을 통해 고르지 않은 그리드를 고려합니다. 그리드의 각 모서리에 대해 8개의 × 8그리드 정사각형 영역과 중앙 양쪽에 2× 8그리드 정사각형 영역이 있으며, 중앙 4개의 그리드 사각형패턴(그림 2, 가운데 이미지)을 그대로 둡니다. 복제 옵션(그림 2, 영역 4)을 사용하여 초기 패턴의 복사본을 생성하여 패턴의 원하는 총 복사본 수에 도달합니다. 필요한 경우 복사본 간의 간격을 조정하여 그리드 사각형 사이의 간격과 일치합니다. 패턴에 대한 총 용량을 설정합니다. 30 mJ / mm2 는 좋은 출발점입니다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. 전문가 옵션(그림 2, 영역 4)에서 영역의 각도를 조정하여 그리드 사각형의 각도와 일치합니다. 영역은 마우스를 사용하여 위치를 지정할 수 있습니다. 패턴의 비율(크기)도 조정할 수 있습니다. 패턴이 그리드 사각형과 정렬될 때까지 패턴의 각도, 위치, 공간 및 비율을 조정하여 반복합니다. 현미경 스테이지를 이동하여 라이브 브라이트필드 디스플레이에서 그리드 영역을 변경합니다. 잠금을 눌러 지역에 대한 변경 사항을 저장합니다. 지역을 복사하려면 왼쪽의 작업 패널에서 이름 옆에 중복 단추(그림 2, 영역 5, 용지 아이콘 2장)를 클릭합니다. 복사본의 위치를 변경, 이름 바꾸기 또는 편집하려면 작업 패널에서 이름을 클릭합니다. 원하는 모든 영역을 채우기 위해 필요에 따라 5.4-5.9 단계를 반복합니다. 전체 템플릿이 설계되고 배치되면 소프트웨어 내에서 템플릿 파일을 저장 합니다(그림 2, 영역 6, 상단 도구 모음에 최대 화살표 아이콘이 있는 막대). 이전에 저장된 템플릿(아래쪽 화살표 아이콘이 있는 막대)을 로드할 때 는 그리드 위에 ROI를 중앙으로 표시하고 잠금을 누릅니다. 동작 패널 의 각 영역을 클릭하여 각도, 위치, 용량 및/또는 패턴 파일을 변경합니다. 템플릿과 패턴이 배치되면 소프트웨어의 작업 패널 의 영역 중 하나를 제외한 모든 영역을 선택 취소합니다. 현미경 단계를 사용하여 해당 영역으로 이동하여 탄소 호일에 집중하십시오. 액션 패널에서 아이볼 아이콘을 클릭하면 패턴 오버레이의 표시가 켜지거나 꺼집니다. 그리드가 포커스가 되면 밝은 필드 셔터를 닫고 소프트웨어 오른쪽 하단에 있는 Play 아이콘을 눌러 실시간으로 모니터링할 수 있는 패터닝 프로세스를 시작합니다. 작업 패널에서 다음 영역에 대한 상자를 선택합니다. 그리드가 표시되도록 밝은 필드 셔터를 열고 현미경 스테이지를 사용하여 해당 영역을 중심으로 합니다. 작업 패널의 각 영역에 대해 5.13-5.14 단계를 반복합니다. 현미경에서 그리드로 커버슬립을 제거하고 멸균 인산염 완충식식염(PBS)의 10 μL을 그리드에 즉시 피펫합니다. 10분 후 핀셋으로 스텐실을 제거한 다음 15μL의 PBS로 그리드 3x를 세척합니다. 마지막 세척 후 각 그리드를 PBS의 15 μL에 배치하고 그리드를 어두운 위치로 이동합니다. 6. ECM 단백질의 증착 배양 된 세포의 경우 6.2-6.5 단계를 따르십시오. 1 차적인 Drosophila 신경을 위해, 단계를 따르십시오 6.6-6.10. 각 그리드에 대해 최소 15μL의 ECM을 준비합니다. BEAS-2B 세포의 경우 멸균 PBS에서 0.01 mg/mL 소 섬유네틴 및 0.01 mg/mL 플루오로포레-공주 피브리노겐의 최종 농도를 준비한다. HeLa 세포의 경우 멸균 PBS에서 0.01 mg/mL 소 콜라겐 I 및 0.1 mg/mL 플루오로포어-컨쥬게이트 피브리노겐을 준비하십시오. 각 그리드에서 대부분의 PBS를 제거하고 ECM의 15 μL을 적용합니다. 적어도 1 시간 동안 실온에서 습한 챔버에서 그리드를 배양한다.참고: 이 단계는 4°C에서 하룻밤사이에 연장될 수 있다. ECM에서 인큐베이션 후 멸균 PBS로 각 그리드 5배세척합니다. 각 세척에 대해 그리드를 건조시키지 않고 파이펫으로 액체의 대부분을 제거하고 신선한 PBS 15 μL을 추가하고 적어도 30 s의 배양하고 반복하십시오. 마지막 세척 후 각 그리드를 PBS에 둡니다.참고: 그리드는 4°C에서 PBS에서 최대 1주일 동안 저장할 수 있으며 품질 저하가 관찰되지 않습니다. 형광 현미경을 사용하여 ECM의 형광소를 감지하여 패터닝을 확인하고 탄소 호일이 그대로 유지된다는 것을 확인하십시오. 깨진 사각형 몇 개는 일반적으로 견딜 수 있습니다. 1차 Drosophila 뉴런의 경우 패턴 그리드를 멸균 PBS를 포함하는 30mm 유리 바닥 접시로 이동합니다. 접시에서 PBS를 흡인하고 멸균 환경에서 25 °C에서 하룻밤 동안 0.5 mg / mL 플루오로포레 -컨쥬게이트 공수 의 2 mL을 적용합니다. 접시에서 concanavalin A 용액을 제거하고 (그리드를 건조하지 않고) PBS로 그리드 3배 세척합니다. 각 세척에 대해 접시에서 2mL PBS를 넣고 제거합니다. 형광 현미경을 사용하여 ECM의 형광소를 감지하여 패터닝을 확인하고 탄소 호일이 그대로 유지된다는 것을 확인하십시오. 깨진 사각형 몇 개는 일반적으로 견딜 수 있습니다. 마지막 세척 후, 유리 바닥 접시에서 PBS를 제거하고 2mL의 신선하게 준비된 멸균 여과 된 슈나이더의 Drosophila media21을 추가하여 20% 열 불활성 태아 소 혈청(FBS), 5 μg/mL 인슐린, 100 μg/mL 페니실린, 100 μg/mL stl, 100 μg/mL stl 뉴런이 도금될 때까지 멸균 환경에서 25°C에서 배양한다. 7. 시드 전에 1 차 적인 Drosophila 세포의 준비 55mm 해부 접시를 70% EtOH로 살균하고, 이어서 멸균 여과 1× 해부 염벽(9.9m HEPES pH 7.5, 137m NaCl, 5.4mM KCl, 0.17 mM NaH2PO4, 0.22m M KH2PO4, 3.3mM 포도당, 43.8mm)의 접시2-3mL을 첨가한다. 핀셋을 사용하여 음식에서 30-40 3번째 인스타 애벌레를 부드럽게 선택하십시오. 1× PBS로 튜브에 애벌레를 넣고 1× PBS로 두 번째 튜브로 옮겨 애벌레를 씻으십시오. 유충을 70%의 EtOH로 튜브로 옮겨 PBS를 씻어낸 다음 70%의 EtOH로 두 번째 튜브로 옮겨 넣습니다. 애벌레를 살균하기 위해 2-3 분 동안 두 번째 튜브에 애벌레를 둡니다. 애벌레를 1× 해부 식염수로 튜브로 옮은 다음 즉시 1× 해부 식염수로 두 번째 튜브로 옮기습니다. 개별 애벌레를 1× 해부 식염수로 함유된 해부 접시에 옮기습니다. 한 쌍의 집게와 해부 현미경으로 각 애벌레를 빠르게 찢어 뇌를 추출하고 1× 해부 식염수로 제 3 튜브로 옮습니다. 모든 뇌가 추출될 때까지 반복합니다. 뇌를 함유하는 튜브를 300 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 상류체를 버리고 1mL의 1mL× 해부 식염수로 씻고 튜브를 300 x g에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 200-250 μL이 튜브에 남아있을 때까지 상체를 버리고 1 x 해부 식염수에 2.5 mg / mL 리베라제20 μL을 추가하십시오. 실온에서 1 시간 동안 회전기에서 튜브를 회전하는 경우; 이 시간 동안, 파이펫 용액은 10 분마다 25-30 배. 끝으로, 솔루션은 약간 불투명해야합니다. 300 × g 에서 세포를 원심 분리하여 5 분 동안. 상체를 폐기한 다음 1mL의 보충제 슈나이더 미디어를 추가합니다. 파이펫을 30번 섞습니다. 300 × g 에서 세포를 원심 분리하여 5 분 동안. 상체를 버리고 슈나이더의 미디어를 보충 한 1 mL을 추가하여 셀 펠릿을 씻으십시오. 파이펫을 30번 섞습니다. 300 × g 에서 세포를 원심 분리하여 5 분 동안. 상체를 폐기한 다음 슈나이더의 미디어를 보충한 300μL로 셀 펠릿을 다시 놓습니다. 파이펫용액을 30-40번 섞는다. 8. BEAS-2B 및 HeLa 세포의 배양 및 RSV 감염 37°C 및 5% CO2에서 T75 플라스크에서 HeLa 세포 및 BEAS-2B 세포를 유지합니다. 통로 세포마다 3-4 일 한 번 약 80 %의 합류에 도달합니다. DMEM + 10% FBS + 1× 항생제 항진균제에서 HeLa 세포를 유지합니다. RPMI + 10% FBS + 1× 항생제-항진균6,22,23에서 BEAS-2B를 유지하십시오. 감염되지 않은 세포의 파종은 9절로 건너뜁니다. BEAS-2B 및 HeLa 세포는 RSV 감염에 취약합니다; BEAS-2B 세포는 여기에 도시된 RSV를 포함하는 모든 실험에 사용되었다.참고: 적절한 생물안전 캐비닛(BSC) 및 개인 보호 장비(PPE)를 사용하여 기관 프로토콜을 준수하여 모든 BSL-2 단계를 수행합니다. 세포의 RSV 감염 이전에는, 5 × 104 세포를 6웰 플레이트(표면적 ~9.6 cm2)로 통과하고 하룻밤 사이에 배양한다. 트립시네이니즈하고 세포의 하나의 우물을 계산합니다. 트립시니화하려면, 하나의 우물에서 미디어를 흡습하고 Mg2 + 및 Ca2 + 없이 멸균 PBS의 2 mL로 세척하여 잔류 매체를 제거합니다. 0.25% 트립신 용액의 500 μL을 추가합니다. 5-10 분 동안 37 °C에서 배양하십시오. 주기적으로 세포를 확인하여 표면에서 방출되는지 확인합니다. 세포가 방출되면 배양 배지의 1.5mL을 추가하십시오. 트립판 블루의 100 μL와 트립시네화된 세포의 100 μL을 섞는다. 희석된 세포 믹스의 파이펫 10 μL이 혈류계로 혼합됩니다. 셀을 계산하고 잘 셀 수를 계산합니다. 이 번호를 사용하여 아래 MOI를 계산합니다. 성장 매체에서 RSV-A2mK+24의 희석을 준비하여 750 μL의 미디어에서 웰당 10개의 MOI를 달성합니다. RSV-A2mK+의 MOI는 주식의 형광 초점 장치(FFU) 티터(예: 우물당 1.0 × 105셀 및 RSV 주식 1.0 × 108 FFU/mL로 계산할 수 있으며, 바이러스 주식 1:75 ~ 1× 106 FFU/750 μL 또는 1.30 μL)×.×.×. 6웰 접시의 세포로부터 미디어를 흡인하고 위에서 각 우물까지 바이러스 용액의 750 μL을 추가합니다. 1 시간 동안 실온에서 접시를 흔들어. 1시간 후, 37°C로 미리 데워진 성장 매체로 최대 2mL당 의 총 부피를 가져와 서 플레이트를 37°C로 설정하여 6h당 5% CO2 로 설정한다. 세포를 풀어 놓기 위해 트립시닝하고 아래에 설명된 대로 파종으로 진행합니다. 시드 후, 급락 동결 전에 추가 18 h에 대한 그리드를 배양 (총 24 시간 감염 후). 9. 마이크로 패턴 그리드에 셀 시드 배양 된 세포의 경우 단계를 따르십시오 9.2-9.8; 1 차적인 Drosophila 신경을 위해, 따라 9.9-9.11. 세포를 풀어 놓기 위해 트립시니즈(위의 섹션 8에서 4단계 참조). 세포 집계를 줄이려면 60% 이하의 수렴성으로 세포를 트립시닉합니다. 트립판 블루의 100 μL와 트립시네화된 세포의 100 μL을 섞는다. 희석된 세포의 파이펫 10 μL은 혈류계로 혼합되어 세포를 계산합니다. 2 × 104 세포 /mL로 매체의 세포를 희석. 30mm 유리 바닥 접시의 중앙에 1 μL의 매체를 추가하여 그리드를 배치하고 건조를 방지합니다. 커버슬립의 PBS에서 유리 바닥 접시의 중심으로 그리드를 전송합니다. 그리드에 셀 용액 10μL을 추가합니다. 밝은 필드 현미경을 사용하여 5 분 후에 그리드에 세포 접착력을 관찰하십시오. 패턴의 대부분이 비어 있는 상태로 유지되면 셀 용액의 10 μL 드롭을 추가합니다. 인큐베이션 중에 그리드 및 셀 용액을 37°C로 유지합니다. 대부분의 패턴이 점유되거나 많은 점유 패턴이 여러 셀을 갖기 시작할 때까지 9.6 단계를 반복합니다. 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 2h의 그리드를 배양한다. 미리 데워진 2mL의 전동 된 매체로 접시를 범람하고 하룻밤 동안 배양 (37 °C, 5 % CO2). 1차 Drosophila 뉴런의 경우 그리드 함유 접시에서 미디어를 제거하고 세포를 접시에 접시에 접시로 플레이트합니다. 세포가 부착될 때까지 30-60분 기다린 다음 2mL의 보충제 슈나이더 미디어를 추가합니다. 급락 동결 전에 최소 2-3 일 동안 25 °C 인큐베이터에서 뉴런을 배양. 10. 패턴 그리드의 이미징 및 진동 형광 현미경에 패턴 그리드 및 배양 된 세포를 포함하는 유리 바닥 접시를 놓습니다. 밝은 필드와 적절한 형광 채널을 사용하여 그리드의 이미지를 획득하여 세포내의 패턴 및 기타 라벨링을 감지합니다. 세포 밀도와 위치 지정이 다운스트림 이미징 및 분석에 적합한지 확인합니다.참고: 브라이트필드와 형광 이미지는 FIJI 소프트웨어 패키지25에서 처리되었습니다. 냉동고 플런지 냉동고를 준비하십시오. 동결 장치의 유형은 샘플에 가장 적합한 가용성, 비용 및 기능에 따라 달라집니다.참고: 1차 드로소필라 뉴런은 자동 플런지-냉동고에 제조되었고, BEAS-2B 세포는 반자동 플런지-냉동고를 사용하여 제조하였다. 틸트 계열의 적절한 정렬을 위해 샘플에 금 신탁을 적용합니다. Blot 샘플은 과잉 매체를 제거하기 위해 샘플을 액체 질소에 의해 냉각된 액체 에탄과 같은 극저온으로 얼게크-고정합니다. 1 차적인 Drosophila 뉴런을 위해, 뒤에서 4 s에 대한 얼룩. HeLa 및 BEAS-2B 세포의 경우, 4-6 s에 대한 양쪽에서 얼룩. 냉동 그리드는 추가 사용이 있을 때까지 액체 질소에 보관할 수 있습니다. 직구 검출기 카메라로 300kV로 작동되는 저온 전자 현미경으로 이미지 진동 세포. cryo-EM/cryo-ET 데이터 수집을 위한 SerialEM26 과 같은 소프트웨어로 관심 있는 각 영역에 대한 틸트 시리즈 컬렉션을 설정합니다.참고: 1차 드로소필라 뉴런의 틸트 시리즈는 -60°에서 60°까지 양방향으로 -8 μm 디포커스에서 2°의 속도로 양방향으로 수집되었으며, 픽셀 크기는 4.628Å로 70-75 e-/Å2의 총 용량으로 수집하였다. RSV-감염된 BEAS-2B의 틸트 시리즈는 -5 μm 디포커스에서 에너지 필터(20 eV 슬릿)를 가진 직접 전자 검출기에 수집되었으며, 총 용량은 ~80 e-/Å2이다. 틸트 계열을 처리하여 토모그램을 재구성합니다.참고: 여기에 제시 된 토모그램은 IMOD 패키지를 사용하여 재구성되었다27; 로우패스 필터링은 EMAN2 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행되었다28.