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Bioquímica

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Published: September 13, 2021
doi:
10.3791/62992
, , ,
1Department of Biochemistry,University of Wisconsin, Madison, 2Cryo-Electron Microscopy Research Center, Department of Biochemistry,University of Wisconsin, Madison, 3Midwest Center for Cryo-Electron Tomography, Department of Biochemistry,University of Wisconsin, Madison, 4Department of Chemistry,University of Wisconsin, Madison, 5Morgridge Institute for Research

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zelladhäsion und das Wachstum auf gezielte Bereiche von Gittern für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu lenken. Dies wird durch das Auftragen einer Antifouling-Schicht erreicht, die in benutzerdefinierten Mustern abgetragen wird, gefolgt von der Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen in den gemusterten Bereichen vor der Zellaussaat.

Abstract

Die Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ist eine leistungsstarke Technologie, die verwendet wird, um Nanometer-Auflösungsstrukturen von Makromolekülen herzustellen, die im zellulären Kontext vorhanden sind und in einem nahezu nativen gefrorenen hydratisierten Zustand konserviert werden. Es gibt jedoch Herausforderungen, die mit der Kultivierung und / oder dem Verkleben von Zellen auf TEM-Gittern in einer Weise verbunden sind, die für die Tomographie geeignet ist, während die Zellen in ihrem physiologischen Zustand erhalten bleiben. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verwendung von Mikrostrukturierung zur Steuerung und Förderung des eukaryotischen Zellwachstums auf TEM-Gittern vorgestellt. Während der Mikrostrukturierung wird das Zellwachstum gesteuert, indem extrazelluläre Matrixproteine (ECM) innerhalb bestimmter Muster und Positionen auf der Folie des TEM-Gitters abgelagert werden, während die anderen Bereiche mit einer Antifouling-Schicht bedeckt bleiben. Flexibilität bei der Wahl der Oberflächenbeschichtung und des Musterdesigns macht die Mikrostrukturierung für eine Vielzahl von Zelltypen breit anwendbar. Mikrostrukturierung ist nützlich für die Untersuchung von Strukturen innerhalb einzelner Zellen sowie komplexerer experimenteller Systeme wie Wirt-Pathogen-Interaktionen oder differenzierten mehrzelligen Gemeinschaften. Mikrostrukturierung kann auch in viele nachgelagerte Ganzzell-Kryo-ET-Workflows integriert werden, einschließlich korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (Kryo-CLEM) und fokussiertem Ionenstrahlfräsen (Kryo-FIB).

Introduction

Mit der Entwicklung, Erweiterung und Vielseitigkeit der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben Forscher eine breite Palette biologischer Proben in einem nahezu nativen Zustand von makromolekularer (~ 1 nm) bis hoher (~ 2 Å) Auflösung untersucht. Einzelpartikel-Kryo-EM- und Elektronenbeugungstechniken werden am besten auf gereinigte Makromoleküle in Lösung bzw. in kristallinem Zustand angewendet1,2. Während die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) einzigartig für nahezu native strukturelle und ultrastrukturelle Untersuchungen großer, heterologer Objekte wie Bakterien, pleomorpher Viren und eukaryotischer Zellen3 geeignet ist. Bei kryo-ET werden dreidimensionale (3D) Informationen erhalten, indem die Probe physikalisch auf dem Mikroskoptisch geneigt und eine Reihe von Bildern durch die Probe in verschiedenen Winkeln aufgenommen wird. Diese Bilder oder Neigungsserien decken oft einen Bereich von +60/-60 Grad in Schritten von ein bis drei Grad ab. Die Neigungsreihe kann dann rechnerisch zu einem 3D-Volumen rekonstruiert werden, das auch als Tomogramm4 bezeichnet wird.

Alle Kryo-EM-Techniken erfordern, dass die Probe in eine dünne Schicht aus amorphem, nichtkristallinem Glaseis eingebettet wird. Eine der am häufigsten verwendeten Kryofixierungstechniken ist das Tauchgefrieren, bei dem die Probe auf das EM-Gitter aufgetragen, abgeschmolzen und schnell in flüssiges Ethan oder eine Mischung aus flüssigem Ethan und Propan getaucht wird. Diese Technik ist ausreichend für die Vitrifikation von Proben von <100 nm bis ~10 μm Dicke, einschließlich kultivierter menschlicher Zellen, wie HeLa-Zellen5,6. Dickere Proben wie Mini-Organoide oder Gewebebiopsien mit einer Dicke von bis zu 200 μm können durch Hochdruckgefrieren vitrifiziert werden7. Aufgrund der erhöhten Elektronenstreuung dickerer Proben ist die Proben- und Eisdicke für Kryo-ET jedoch in 300-kV-Transmissionselektronenmikroskopen auf ~ 0,5 – 1 μm begrenzt. Daher ist die Ganzzell-Kryo-ET vieler eukaryotischer Zellen auf die Zellperipherie oder Erweiterungen von Zellen beschränkt, es sei denn, es werden zusätzliche Probenvorbereitungsschritte wie Kryoschnitt8 oder fokussiertes Ionenstrahlfräsen9,10,11 verwendet.

Eine Einschränkung vieler Ganzzell-Kryo-ET-Bildgebungsexperimente ist der Datenerfassungsdurchsatz12. Im Gegensatz zu Einzelpartikel-Kryo-EM, bei dem Tausende von isolierten Partikeln oft von einem einzigen TEM-Gitterquadrat abgebildet werden können, sind Zellen groß, verteilt und müssen mit einer ausreichend niedrigen Dichte gezüchtet werden, damit die Zellen in einer dünnen Schicht glasartigen Eises konserviert werden können. Oft ist die Region von Interesse auf ein bestimmtes Merkmal oder einen Teilbereich der Zelle beschränkt. Eine weitere Einschränkung des Durchsatzes ist die Neigung von Zellen, auf Bereichen zu wachsen, die für die TEM-Bildgebung nicht zugänglich sind, z. B. auf oder in der Nähe von TEM-Gitterstäben. Aufgrund unvorhersehbarer Faktoren, die mit Zellkulturen auf TEM-Grids verbunden sind, sind technologische Entwicklungen erforderlich, um die Zugänglichkeit der Proben und den Durchsatz für die Datenerfassung zu verbessern.

Die Substratmikrostrukturierung mit adhärenten extrazellulären Matrixproteinen (ECM) ist eine etablierte Technik für die Lebendzell-Lichtmikroskopie, um das Wachstum von Zellen auf starre, langlebige und optisch transparente Oberflächen wie Glas und andere Gewebekultursubstrate zu lenken13,14. Mikrostrukturierung wurde auch auf weichen und/oder dreidimensionalen (3D) Oberflächen durchgeführt. Solche Techniken haben nicht nur die präzise Positionierung von Zellen ermöglicht; Sie haben auch die Schaffung multizellulärer Netzwerke unterstützt, wie z. B. gemusterte neuronale Zellschaltkreise15. Die Einführung von Mikrostrukturierung auf Kryo-ET wird nicht nur den Durchsatz erhöhen, sondern auch neue Studien für die Erforschung komplexer und dynamischer zellulärer Mikroumgebungen eröffnen.

In jüngster Zeit haben mehrere Gruppen begonnen, Mikrostrukturierungstechniken auf TEM-Gittern durch mehrere Ansätze zu verwenden16,17. Hier wird der Einsatz einer maskenlosen Photostrukturierungstechnik für TEM-Gitter mit dem Mikrostrukturierungssystem Alvéole PRIMO beschrieben, das über eine hochauflösende und kontaktlose Musterung verfügt. Bei diesem Mikrostrukturierungssystem wird eine Antifouling-Schicht auf die Oberseite des Substrats aufgetragen, gefolgt von der Anwendung eines Photokatalysators und der Ablation der Anti-Fouling-Schicht in benutzerdefinierten Mustern mit einem UV-Laser. ECM-Proteine können dann zu den Mustern für die entsprechende Zellkultur hinzugefügt werden. Diese Methode wurde von mehreren Gruppen für Kryo-ET-Studien an retinalen Pigmentepithel-1 (RPE1), Madin-Darby-Hundenieren-II (MDCKII), menschlichen Vorhautfibroblasten (HFF) und endothelialen Zelllinien verwendet16,17,18. Dieses Mikrostrukturierungssystem ist mit mehreren Antifouling-Schichtsubstraten sowie entweder einem flüssigen oder Gel-Photokatalysator-Reagenz kompatibel. Eine Vielzahl von ECM-Proteinen kann aus der Spezifität der Zelllinie ausgewählt und angepasst werden, was dem Benutzer Vielseitigkeit verleiht.

Mikrostrukturierung wurde erfolgreich auf eine Reihe von Projekten innerhalb des Labors angewendet19. Hier wird ein Mikrostrukturierungsprotokoll vorgestellt, einschließlich spezifischer Anpassungen zur Untersuchung kultivierter HeLa-Zellen, mit dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) infizierter BEAS-2B-Zellen und primärer Larven-Drosophila melanogaster-Neuronen20.

Protocol

Das hier beschriebene Protokoll ist eine Zusammenstellung der Zellkultur-, Mikrostrukturierungs- und Bildgebungsmethoden, die vom Wright-Labor und dem Cryo-EM-Forschungszentrum an der University of Wisconsin, Madison, verwendet werden. Der Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Zusätzliche Schulungs- und Schulungsmaterialien sind an folgenden Standorten erhältlich: https://cryoem.wisc.edu oder https://wrightlab.wisc.edu 1. Vorbereitung von Gittern für die Musterung Übertragen Sie die TEM-Gitter auf einen sauberen Glasobjektträger mit der Kohlenstoffseite nach oben (die Standarddicke der Kohlenstofffolie beträgt 12 nm). Mit einem Kohlenstoffverdampfer, ACE600, verdampfen Sie 5-8 nm zusätzlichen Kohlenstoff auf die Gitter, um die Gesamthaltbarkeit des Kohlenstofffilms zu erhöhen.HINWEIS: Dieser Schritt ist für SiO2-Gitter nicht erforderlich. Dieser Schritt kann auch im Voraus durchgeführt werden; Lagern Sie die beschichteten Gitter in einer Umgebung mit niedriger Luftfeuchtigkeit, z. B. einem Vakuum-Exsikkator. Übertragen Sie die Gitter auf einen Gittervorbereitungshalter und entlüften Sie die Gitter mit der Kohlenstoffseite nach oben. Mit einem Glühentladungssystem entlädt das Glühen die Gitter für 60 s bei 10 mA mit einem Arbeitsabstand von 80 mm und einem Vakuumdruck von 1,0 x 10-3 mbar. Tun Sie dies innerhalb von 15-30 Minuten nach dem nächsten Schritt.HINWEIS: Gittervorbereitungshalter können im Handel gekauft oder mit einem Stück Filterpapier auf einer kleinen Petrischale selbst hergestellt werden. 2. Auftragen der Antifouling-Schicht HINWEIS: Bei der Handhabung der Gitter sollte eine geeignete sterile Technik angewendet werden, und alle Lösungen sollten steril und / oder filtersterilisiert sein. Übertragen Sie die Gitter (Carbonseite nach oben) auf einen sauberen Glasträger oder Deckglas mit mindestens 1 cm Abstand zwischen den Gittern. 10 μL 0,05% Poly-L-Lysin (PLL) werden auf jedes Gitter pipettiert. Inkubieren Sie die Gitter in einer feuchten Kammer, z. B. einer geschlossenen Plastikbox mit feuchten Papiertüchern, für mindestens 30 Minuten.HINWEIS: Dieser Schritt kann bis über Nacht verlängert werden. Stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit in der Kammer ausreicht, um ein Austrocknen der Gitter zu verhindern. Waschen Sie jedes Gitter dreimal mit 15 μL 0,1 M HEPES pH 8,5. Entfernen Sie bei jeder Wäsche den größten Teil der Flüssigkeit mit einer Pipette aus dem Gitter, ohne das Gitter trocknen zu lassen. 15 μL frischen Puffer zugeben, mindestens 30 s inkubieren und wiederholen. Lassen Sie jedes Gitter nach dem letzten Waschen in 15 μL 0,1 M HEPES.HINWEIS: In diesem Schritt und in zukünftigen Schritten ist es wichtig, das Gitter nass zu halten und den Kontakt zwischen der Pipette und dem Gitter zu vermeiden. Bereiten Sie 10 μL 100 mg/ml Polyethylenglykol-Succinimidylvalerat (PEG-SVA) in 0,1 M HEPES pH 8,5 für jedes Gitter vor. Das PEG-SVA löst sich schnell durch sanftes Mischen auf, was zu einer klaren Lösung führt.HINWEIS: Bereiten Sie die PEG-SVA-Lösung nicht im Voraus vor. PEG-SVA hat eine Halbwertszeit von 10 min bei pH 8,5. Vermeiden Sie es, den PEG-SVA-Bestand übermäßiger Feuchtigkeit auszusetzen, indem Sie ihn in einem Exsikkator oder in trockener Umgebung bei -20 °C lagern und vor dem Öffnen auf Raumtemperatur erwärmen. Unmittelbar nach der Vorbereitung der PEG-SVA-Lösung wird der 15-μL-Tropfen HEPES pH 8,5 aus jedem Gitter entfernt (wobei darauf zu achten ist, dass das Gitter nicht getrocknet wird) und ein 10-μL-Tropfen der PEG-SVA-Lösung hinzugefügt. Inkubieren Sie die Gitter in einer feuchten Kammer für mindestens 1 h.HINWEIS: Dieser Schritt kann bis über Nacht verlängert werden. Stellen Sie sicher, dass die Feuchtigkeit in der Kammer ausreicht, um ein Austrocknen der Gitter zu verhindern. Waschen Sie jedes Gitter dreimal mit 15 μL sterilem Wasser. Für jede Wäsche den größten Teil der Flüssigkeit mit einer Pipette aus dem Gitter entfernen, ohne das Gitter trocknen zu lassen, 15 μL Frischewasser hinzufügen, mindestens 30 s inkubieren und wiederholen. Lassen Sie jedes Gitter nach der letzten Wäsche in 15 μL Wasser. 3. PLPP-Gel auftragen Bereiten Sie für jedes Gitter einen sauberen Mikroskop-Deckglas vor. Führen Sie die folgenden Schritte für jedes Raster aus, jeweils ein Raster, um die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass das Raster austrocknet. Legen Sie einen 1,0 μL Wassertropfen auf die Mitte des Deckglases, um das Gitter auf den Deckglas zu legen und das Gitter nass zu halten. Übertragen Sie das Gitter vorsichtig vom 15 μL Wassertropfen auf den 1,0 μL Wassertropfen auf dem Deckglas. Stellen Sie sicher, dass Sie das Gitter mit der Carbonseite nach oben stellen. Legen Sie vorsichtig eine Polydimethylsiloxan (PDMS) Schablone über das Gitter, wobei darauf zu achten ist, dass das Gitter zentriert bleibt und der Schablonenkontakt mit der Kohlenstofffolie des Gitters minimiert wird. 1,0 μL 4-Benzoylbenzyl-Trimethylammoniumchlorid (PLPP)-Gel auf das Gitter geben. Vorsichtig zum Mischen pipettieren (das Gitter nicht mit der Pipettenspitze berühren). Bewegen Sie das Deckglas mit dem Gitter zum Trocknen an eine dunkle Stelle. Das Gel trocknet in ca. 15-30 min. 4. Kalibrierung und Design des Mikromusters Färben Sie eine Seite eines Glasdeckglases mit einem Textmarker. Fügen Sie schwarze Linien von einem feinen Permanentmarker hinzu, um die Fokussierung zu erleichtern. Legen Sie den Deckglas auf das Mikroskop, so dass die farbige Seite der Objektivlinse zugewandt ist. Konzentrieren Sie sich im Hellfeldmodus auf den Textmarker. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop und das Mikrostrukturierungssystem eingeschaltet sind und der richtige Lichtweg eingestellt ist. Öffnen Sie Micromanager und die Leonardo-Software (Plugins > Leonardo) auf dem Mikroskopcomputer. Wählen Sie Kalibrieren und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm. Passen Sie den Mikroskopfokus so an, dass das auf den Objektträger projizierte Bild scharf ist. Die Belichtungszeit muss möglicherweise verkürzt werden. Wählen Sie nach der Kalibrierung “Jetzt mustern”. Notieren Sie das Mikrometer/Pixel-Verhältnis (μm/px), das unter den Kalibrierungsdaten im oberen linken Fenster des Programms gemeldet wird (Abbildung 2, Bereich 1). Verwenden Sie dieses Verhältnis, um die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die pro Mikrometer beim Entwerfen eines Musters verwendet werden sollen. Stellen Sie nach der Kalibrierung sicher, dass die Software jetzt mit einer Live-Hellfeldansicht vom Mikroskop aus geöffnet ist. Laden Sie ein vorbereitetes Gitter auf einem Deckglas (Abschnitt 3) auf die Bühne, wobei das Gitter der Objektivlinse zugewandt ist. Positionieren Sie die Bühne und passen Sie den Fokus so an, dass das Raster im Softwarefenster sichtbar ist. Messen Sie die Größe der Gitterquadrate und Gitterbalken in Mikrometern. Die Software enthält ein Lineal, das durch die Schaltfläche in der nähe der unteren linken Ecke aktiviert wird, um das Raster zu messen (Abbildung 2, Bereich 2). Beispielsweise entsprechen die hier für ein 200-Mesh-Gitter verwendeten Muster ~87 × 87 μm Gitterquadraten und ~36 μm Gitterbalken.HINWEIS: Die Software bietet Flexibilität bei der Änderung von Größenmustern im laufenden Betrieb, sodass geringfügige Ungenauigkeiten bei der Messung toleriert werden können. Erstellen Sie basierend auf den oben genannten Messungen und Verhältnissen Muster mit einer beliebigen Bilderstellungssoftware. Die minimale Merkmalsgröße mit einem 20× Objektiv beträgt 1,2 μm. Muster sollten als unkomprimierte 8-Bit-.tiff Dateien gespeichert werden. Stellen Sie sicher, dass die Software beim Speichern keine Bilder auf eine andere Pixelgröße skaliert. Das Muster sollte in eine 800-× 800-Pixel-Box passen, die ausreicht, um vier Rasterquadrate abzudecken.HINWEIS: Pixel mit einem Wert von 255 (weiß) werden mit der höchsten Intensität (Gesamtdosis des Lasers) gemustert und Pixel mit einem Wert von Null (schwarz) werden nicht gemustert. Alle Pixel mit einem Zwischenwert werden mit einer Dosis von ungefähr (X/255)*Gesamtdosis gemustert. In Abbildung 3A wurden Pixelwerte von 255 und 129 für die Graustufenmuster verwendet. Sobald das Muster entworfen ist, kann es gespeichert und ohne Änderungen wiederverwendet werden. 5. Mikrostrukturierung Stellen Sie nach der Kalibrierung sicher, dass die Software jetzt mit einer Live-Hellfeldansicht vom Mikroskop aus geöffnet ist. Laden Sie ein vorbereitetes Gitter auf einem Deckglas (Abschnitt 3) auf die Bühne, wobei das Gitter der Objektivlinse zugewandt ist. Positionieren Sie die Bühne und passen Sie den Fokus an, um das Raster in der Software zu sehen. Entwerfen Sie für eine erste Ausführung eine neue Vorlage. Wählen Sie in der Software ROI hinzufügen (nicht angezeigt, in der Position von Abbildung 2 Bereich 3) und wählen Sie einen 3.000 μm Kreis aus. Positionieren Sie den Kreis-ROI über dem Raster, indem Sie das Hellfeldbild auf dem Bildschirm als Leitfaden verwenden. Drücken Sie die Sperre, um den ROI zu sichern. Nachdem Sie den ROI fixiert haben, wählen Sie Muster hinzufügen aus (nicht in der Position von Abbildung 2 Bereich 3 dargestellt). Wählen Sie das in Abschnitt 4 entworfene Muster aus. Teilen Sie das Raster in sechs Bereiche auf, um eine unabhängige Fokussierung und Positionierung in jeder Region zu ermöglichen, um ungleichmäßige Gitter zu berücksichtigen. Ein 8-× 8-Raster-Quadrat-Bereich für jede Ecke des Rasters und ein 2-× 8-Raster-Quadrat-Bereich auf jeder Seite des Zentrums, so dass die mittleren vier Rasterquadrate nicht gemustert bleiben (Abbildung 2, mittleres Bild). Verwenden Sie die Replikationsoptionen (Abbildung 2, Bereich 4), um Kopien des ursprünglichen Musters zu generieren, um die gewünschte Anzahl von Gesamtkopien des Musters zu erreichen. Passen Sie den Abstand zwischen den Kopien bei Bedarf an den Abstand zwischen den Rasterquadraten an. Stellen Sie die Gesamtdosis für das Muster ein. 30 mJ/mm2 ist ein guter Ausgangspunkt. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsabschnitt. Passen Sie unter Expertenoptionen (Abbildung 2, Bereich 4) den Winkel des Bereichs an den Winkel der Rasterquadrate an. Bereiche können mit der Maus neu positioniert werden. Das Verhältnis (Größe) der Muster kann ebenfalls angepasst werden. Iterieren Sie durch Anpassen des Winkels, der Position, des Abstands zwischen und des Verhältnisses des Musters, bis die Muster mit den Rasterquadraten übereinstimmen. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um den Bereich des Rasters in der Live-Hellfeldanzeige zu ändern. Drücken Sie die Sperre , um die an der Region vorgenommenen Änderungen zu speichern. Um einen Bereich zu kopieren, klicken Sie im Bedienfeld “Aktionen” auf der linken Seite neben dem Namen auf die Schaltfläche “Duplizieren” (Abbildung 2, Bereich 5, Symbol “Zwei Blatt Papier”). Um die Kopie neu zu positionieren, umzubenennen oder zu bearbeiten, klicken Sie im Aktionsfenster auf ihren Namen. Wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.9 nach Bedarf, um alle gewünschten Bereiche zu füllen. Sobald die vollständige Vorlage entworfen und positioniert ist, speichern Sie die Vorlagendatei in der Software (Abbildung 2, Bereich 6, Leiste mit Pfeilsymbol nach oben in der oberen Symbolleiste). Beim Laden einer zuvor gespeicherten Vorlage (Leiste mit Abwärtspfeilsymbol) den ROI über das Raster zentrieren und Sperre drücken. Klicken Sie auf jede Region im Aktionsbereich, um den Winkel, die Position, die Dosis und/oder die Musterdatei zu ändern. Sobald die Vorlage und die Muster positioniert sind, deaktivieren Sie alle Bereiche bis auf einen im Aktionsbereich der Software. Verwenden Sie den Mikroskoptisch, um zu diesem Bereich zu navigieren und konzentrieren Sie sich auf die Kohlenstofffolie. Durch Klicken auf das Augapfelsymbol im Aktionsfenster (Abbildung 2, Bereich 5) wird die Anzeige der Musterüberlagerung ein- oder ausgeschaltet. Sobald das Raster scharf ist, schließen Sie den Hellfeldverschluss und drücken Sie das Wiedergabesymbol in der unteren rechten Ecke der Software, um den Musterungsprozess zu starten, der live überwacht werden kann. Aktivieren Sie im Aktionsbereich das Kontrollkästchen für die nächste Region. Öffnen Sie den Hellfeldverschluss, so dass das Gitter sichtbar ist, und zentrieren Sie diesen Bereich mit dem Mikroskoptisch. Wiederholen Sie die Schritte 5.13-5.14 für jede Region im Aktionsbereich. Entfernen Sie den Deckglas mit dem Gitter aus dem Mikroskop und pipettieren Sie sofort 10 μL sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf das Gitter. Nach 10 min die Schablone mit einer Pinzette entfernen, dann das Gitter 3x mit 15 μL PBS waschen. Legen Sie nach der letzten Wäsche jedes Gitter in 15 μL PBS und bewegen Sie die Gitter an einen dunklen Ort. 6. Ablagerung von ECM-Proteinen Führen Sie für kultivierte Zellen die Schritte 6.2-6.5 aus. Führen Sie für primäre Drosophila-Neuronen die Schritte 6.6-6.10 aus. Bereiten Sie mindestens 15 μL ECM für jedes Gitter vor. Für BEAS-2B-Zellen ist eine Endkonzentration von 0,01 mg/ml Rinderfibronektin und 0,01 mg/ml Fluorophor-konjugiertem Fibrinogen in sterilem PBS herzustellen. Für HeLa-Zellen werden 0,01 mg/ml Rinderkollagen I und 0,1 mg/ml Fluorophor-konjugiertes Fibrinogen in sterilem PBS hergestellt. Entfernen Sie den größten Teil des PBS aus jedem Raster und tragen Sie 15 μL des ECM auf. Inkubieren Sie das Gitter in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.HINWEIS: Dieser Schritt kann bis über Nacht bei 4 °C verlängert werden. Nach der Inkubation in ECM jedes Gitter 5x mit sterilem PBS waschen. Für jede Wäsche den größten Teil der Flüssigkeit mit einer Pipette entfernen, ohne das Gitter trocknen zu lassen, 15 μL frisches PBS hinzufügen, mindestens 30 s inkubieren und wiederholen. Lassen Sie jedes Gitter nach der letzten Wäsche in PBS.HINWEIS: Gitter können bis zu einer Woche in PBS bei 4 °C gelagert werden, ohne dass eine Qualitätsverschlechterung beobachtet wird. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um den Fluorophor im ECM zu detektieren, um die Musterung zu bestätigen und zu bestätigen, dass die Kohlenstofffolie intakt geblieben ist. Ein paar gebrochene Quadrate sind im Allgemeinen tolerierbar. Für primäre Drosophila-Neuronen bewegen Sie die gemusterten Gitter in eine 30-mm-Glasbodenschale, die steriles PBS enthält. Das PBS aus der Schale absaugen und 2 ml 0,5 mg/ml Fluorophor-konjugiertes Concanavalin A auftragen. Über Nacht bei 25 °C in steriler Umgebung inkubieren. Entfernen Sie die Concanavalin A-Lösung aus der Schale (ohne die Gitter zu trocknen) und waschen Sie die Gitter 3x mit PBS. Für jede Wäsche fügen Sie 2 ml PBS hinzu und entfernen Sie sie aus dem Geschirr. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um den Fluorophor im ECM zu detektieren, um die Musterung zu bestätigen und zu bestätigen, dass die Kohlenstofffolie intakt geblieben ist. Ein paar gebrochene Quadrate sind im Allgemeinen tolerierbar. Nach der letzten Wäsche entfernen Sie das PBS aus der Glasbodenschale und fügen Sie 2 ml frisch zubereitetes, steril gefiltertes Ergänztes Schneider’s Drosophila media21 hinzu, das 20% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 5 μg/ml Insulin, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 μg/ml Tetracyclin enthält. Inkubieren Sie bei 25 °C in einer sterilen Umgebung, bis die Neuronen bereit sind, plattiert zu werden. 7. Vorbereitung primärer Drosophila-Zellen vor der Aussaat Sterilisieren Sie eine 55-mm-Dissektionsschale mit 70% EtOH und geben Sie dann 2-3 ml steril gefilterte 1×-Dissektionsaline (9,9 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM KH2PO4, 3,3 mM Glucose, 43,8 mM Saccharose) in die Schale. 30-40 Larven im 3. Stadium vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Futter pflücken. Legen Sie die Larven mit 1× PBS in die Röhre und übertragen Sie sie dann in die zweite Röhre mit 1× PBS, um die Larven zu waschen. Übertragen Sie die Larven mit 70% EtOH in die Röhre, um das PBS abzuwaschen, und übertragen Sie sie dann mit 70% EtOH in das zweite Röhrchen. Lassen Sie die Larven in der zweiten Tube für 2-3 min, um die Larven zu sterilisieren. Übertragen Sie die Larven in eine Röhre mit 1× Dissektionssalzlösung, dann übertragen Sie sie sofort in die zweite Röhre mit 1× Dissektionssalzlösung. Einzelne Larven auf die Sezierschale mit 1× Seziersalzlösung geben. Mit einer Pinzette und einem Dissektionsmikroskop reißen Sie schnell jede Larve, um das Gehirn zu extrahieren und es mit 1× Dissektionssalzlösung in die dritte Röhre zu übertragen. Wiederholen Sie dies, bis alle Gehirne extrahiert sind. Zentrifugieren Sie die Röhre, die die Gehirne enthält, bei 300 x g für 1 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 1 ml 1× Seziersalzlösung und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Verwerfen Sie den Überstand, bis 200-250 μL im Röhrchen verbleiben, und fügen Sie 20 μL 2,5 mg/ ml Liberase in 1x Dissektionsaline hinzu. Drehen Sie das Rohr auf einem Rotator für 1 h bei Raumtemperatur; Während dieser Stunde die Lösung 25-30 Mal alle 10 Minuten pipettieren. Am Ende sollte die Lösung etwas undurchsichtig sein. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie dann 1 ml der ergänzten Schneider-Medien hinzu. Die Lösung 30 Mal pipettieren, um sie zu mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet, indem Sie 1 ml zusätzliche Schneider-Medien hinzufügen. Die Lösung 30 Mal pipettieren, um sie zu mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann das Zellpellet mit 300 μL ergänzten Schneider-Medien. Die Lösung 30-40 Mal pipettieren, um sie zu mischen. 8. Kultur- und RSV-Infektion von BEAS-2B- und HeLa-Zellen HeLa-Zellen und BEAS-2B-Zellen in T75-Kolben bei 37 °C und 5 % CO2 aufbewahren. Passagezellen alle 3-4 Tage, sobald sie etwa 80% Konfluenz erreicht haben. Halten Sie HeLa-Zellen in DMEM + 10% FBS + 1× Antibiotikum-Antimykotikum. Halten Sie BEAS-2B in RPMI + 10% FBS + 1× Antibiotikum-Antimykotika6,22,23. Für das Seeding von nicht infizierten Zellen fahren Sie mit Abschnitt 9 fort. BEAS-2B- und HeLa-Zellen sind anfällig für RSV-Infektionen; BEAS-2B-Zellen wurden für alle hier gezeigten Experimente mit RSV verwendet.HINWEIS: Führen Sie alle BSL-2-Schritte in Übereinstimmung mit den institutionellen Protokollen unter Verwendung einer geeigneten Biosicherheitswerkbank (BSC) und persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durch. Vor der RSV-Infektion der Zellen passieren 5 × 104 Zellen pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte (Oberfläche ~ 9,6 cm2) mit 2 ml Wachstumsmedien und inkubieren über Nacht. Trypsinisieren und zählen Sie eine Vertiefung von Zellen. Zum Trypsinisieren die Medien aus einer Vertiefung absaugen und mit 2 ml sterilem PBS ohne Mg2+ und Ca2+ waschen, um Restmedien zu entfernen. Fügen Sie 500 μL 0,25% Trypsin-Lösung hinzu. Bei 37 °C für 5-10 min inkubieren. Überprüfen Sie die Zellen regelmäßig, um festzustellen, ob sie von der Oberfläche freigesetzt werden. Sobald die Zellen freigesetzt sind, fügen Sie 1,5 ml Kulturmedium hinzu. Mischen Sie 100 μL trypsinisierte Zellen mit 100 μL Trypanblau. 10 μL verdünnte Zellmischung werden in ein Hämozytometer pipettiert. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Vertiefung. Verwenden Sie diese Zahl, um den MOI unten zu berechnen. Bereiten Sie eine Verdünnung von RSV-A2mK+24 in Wachstumsmedien vor, um einen MOI von 10 pro Well in 750 μL Medien zu erreichen. Der MOI von RSV-A2mK+ kann aus Fluoreszenzfokuseinheiten (FFU) Titern des Bestands berechnet werden (zum Beispiel: für 1,0 × 105 Zellen pro Bohrung und einen RSV-Bestand von 1,0 × 108 FFU/ml, verdünnen Sie den Virusbestand 1:75 bis 1 × 106 FFU/750 μL oder 1,33 × 106 FFU/mL). Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen in der 6-Well-Schale und geben Sie 750 μL der Virallösung von oben zu jeder Vertiefung hinzu. Die Platte bei Raumtemperatur 1 h schaukeln. Nach 1 h das Gesamtvolumen pro Vertiefung auf bis zu 2 ml bringen, wobei die Wachstumsmedien auf 37 °C vorgewärmt sind, und die Platte in einen auf 37 °C eingestellten Inkubator mit 5% CO2 für 6 h stellen. Trypsinisieren Sie die Zellen, um sie freizusetzen, und fahren Sie mit dem Seeding wie unten beschrieben fort. Nach der Aussaat inkubieren Sie die Gitter für weitere 18 h, bevor Sie einfrieren (für insgesamt 24 h nach der Infektion). 9. Cell Seeding auf mikrostrukturierte Gitter Führen Sie für kultivierte Zellen die Schritte 9.2-9.8 aus. für primäre Drosophila-Neuronen folgen 9.9-9.11. Trypsinisieren Sie die Zellen, um sie freizusetzen (siehe Schritt 4 in Abschnitt 8 oben). Um die Zellaggregation zu reduzieren, trypsinisieren Sie die Zellen bei 60 % oder weniger Konfluenz. Mischen Sie 100 μL trypsinisierte Zellen mit 100 μL Trypanblau. 10 μL der verdünnten Zellmischung in ein Hämozytometer pipettieren und die Zellen zählen. Verdünnen Sie die Zellen in einem Medium auf 2 × 104 Zellen/ ml. Fügen Sie 1 μL Medien in die Mitte einer 30-mm-Glasbodenschale hinzu, um das Aufbringen des Gitters zu erleichtern und ein Austrocknen zu verhindern. Übertragen Sie das Gitter vom PBS auf dem Deckglas in die Mitte der Glasbodenschale. Fügen Sie dem Gitter 10 μL Zelllösung hinzu. Beobachten Sie mit einem Hellfeldmikroskop die Zelladhäsion am Gitter nach 5 minuten. Wenn ein Großteil der Muster unbesetzt bleibt, fügen Sie einen zusätzlichen 10-μL-Tropfen der Zelllösung hinzu. Halten Sie die Gitter und die Zelllösung während der Inkubationen bei 37 °C. Wiederholen Sie Schritt 9.6, bis die meisten Muster belegt sind oder viele belegte Muster mehrere Zellen aufweisen. Inkubieren Sie das Gitter für 2 h im Inkubator (37 °C, 5% CO2). Fluten Sie die Schale mit 2 ml vorgewärmten Medien und inkubieren Sie sie über Nacht (37 °C, 5% CO2). Für primäre Drosophila-Neuronen entfernen Sie das Medium aus der gitterhaltigen Schale und planschen Sie die Zellen auf die Schale. Warten Sie 30-60 Minuten, bis die Zellen befestigt sind, und fügen Sie dann 2 ml ergänzte Schneider-Medien hinzu. Kultivieren Sie die Neuronen in einem 25 ° C-Inkubator für mindestens 2-3 Tage, bevor Sie einfrieren. 10. Abbildung und Vitrifikation von gemusterten Gittern Legen Sie die Glasbodenschale mit dem gemusterten Gitter und den kultivierten Zellen auf das Fluoreszenzmikroskop. Erfassen Sie Bilder des Gitters unter Verwendung des Hellfelds und der entsprechenden Fluoreszenzkanäle, um das Muster und andere Markierungen in den Zellen zu erkennen. Stellen Sie sicher, dass die Zelldichte und -positionierung für die nachgeschaltete Bildgebung und Analyse geeignet ist.HINWEIS: Hellfeld- und Fluoreszenzbilder wurden im FIJI-Softwarepaket25 verarbeitet. Bereiten Sie einen Kryo-Tauchgefrierschrank vor; Die Art des Gefriergeräts hängt von der Verfügbarkeit, den Kosten und den Merkmalen ab, die für die Probe am besten geeignet sind.HINWEIS: Primäre Drosophila-Neuronen wurden auf einem automatisierten Tauch-Gefrierschrank hergestellt, und die BEAS-2B-Zellen wurden mit einem halbautomatischen Tauch-Gefrierschrank hergestellt. Tragen Sie Goldfidaziale auf die Proben auf, um die Neigungsreihe richtig auszurichten. Tupfen Sie Proben ab, um überschüssige Medien zu entfernen, und frieren Sie die Proben dann in ein Kryogen ein, z. B. flüssiges Ethan, das durch flüssigen Stickstoff gekühlt wird. Für primäre Drosophila-Neuronen , tupfen Sie für 4 s von der Rückseite. Für HeLa- und BEAS-2B-Zellen von beiden Seiten für 4-6 s abtupfen. Die gefrorenen Gitter können dann bis zur weiteren Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Bild von verglasten Zellen in einem Kryo-Elektronenmikroskop, betrieben bei 300 kV mit einer direkten Elektronendetektorkamera. Richten Sie die Tilt-Series-Sammlung für jede Region von Interesse mit Software wie SerialEM26 für die Kryo-EM/Kryo-ET-Datenerfassung ein.HINWEIS: Die Tilt-Serie primärer Drosophila-Neuronen wurde auf einem direkten Elektronendetektor von -60° bis 60° bidirektional in 2°-Schritten bei -8 μm Defokussierung mit einer Pixelgröße von 4,628 Å für eine Gesamtdosis von 70-75 e-/Å2 gesammelt. Tilt-Serien von RSV-infizierten BEAS-2B wurden auf einem direkten Elektronendetektor mit einem Energiefilter (20 eV Spalt) bei -5 μm Defokussierung mit einer Pixelgröße von 4,603 Å und einer Gesamtdosis von ~80 e-/Å2 gesammelt. Verarbeiten Sie die Neigungsreihe, um Tomogramme zu rekonstruieren.HINWEIS: Die hier vorgestellten Tomogramme wurden mit dem IMOD-Paket rekonstruiert27; Die Tiefpassfilterung erfolgte mit dem EMAN2-Softwarepaket28.

Representative Results

Dieses Verfahren wurde verwendet, um EM-Gitter für Kryo-ET-Experimente mit ganzen Zellen zu strukturieren. Der gesamte in dieser Studie vorgestellte Workflow, einschließlich der ersten Zellkulturpräparate, der Mikrostrukturierung (Abbildung 1) und der Bildgebung, umfasst 3-7 Tage. In einem zweistufigen Verfahren wurde die Antifouling-Schicht erzeugt, indem PLL auf das Gitter aufgetragen und anschließend PEG durch Zugabe des reaktiven PEG-SVA verknüpft wurde. Die Antifouling-Schicht kann auch in einem einzigen Schritt durch Zugabe von PLL-g-PEG in einer Inkubation aufgetragen werden. Das PLPP-Gel ist ein Katalysator für die UV-Mikrostrukturierung, die auch als weniger konzentrierte Flüssigkeit erhältlich ist. Das Gel ermöglicht eine Musterung mit einer deutlich reduzierten Dosis im Vergleich zur Flüssigkeit, was zu einer viel schnelleren Musterung führt. Mit diesem System betrug die tatsächliche Strukturierungszeit eines vollständigen TEM-Gitters ~ 2 Minuten. Allein der Mikrostrukturierungs-Workflow erstreckt sich in der Regel über 5-6 Stunden und ermöglicht es einer Person, acht Gitter für die Standardzellkultur auf TEM-Gittern zu strukturieren. Einige der Schritte während des Mikrostrukturierungsprozesses erfordern lange Inkubationszeiten (siehe Schritte 2.1, 2.3, 6.4). Praktischerweise können einige dieser Schritte, wie die PLL-Passivierung (2.1) oder die PEG-SVA-Passivierung (2.3), auf eine nächtliche Inkubation ausgedehnt werden. Zusätzlich können Gitter im Voraus gemustert und in einer Lösung des ECM-Proteins oder PBS zur späteren Verwendung gelagert werden. In unserer Studie waren diese Optionen in Fällen wertvoll, in denen das Timing der Zellvorbereitung und -aussaat kritisch ist, wie z.B. primäre Drosophila-Neuronen und RSV-Infektion von BEAS-2B-Zellen. Die Gitter wurden in einem Labor der allgemeinen Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) mit sauberen Werkzeugen und sterilen Lösungen hergestellt und enthielten Antibiotika/Antimykotika in den Wachstumsmedien6,22,29,30. Bei Proben, die besonders empfindlich auf mikrobielle Kontamination reagieren, können die Antifouling-Schicht und das ECM in einer Gewebekulturhaube oder einer anderen sterilen Umgebung aufgetragen werden. Zusätzlich könnte das Gitter zwischen Musterung und ECM-Anwendung in Ethanol gewaschen werden. Bei der Arbeit mit Infektionserregern ist es wichtig, das Verfahren so anzupassen, dass es den entsprechenden Biosicherheitsprotokollen entspricht. Dieser Workflow und die vorgestellten Verfahren (Abbildung 1) ermöglichten es HeLa-Zellen (Abbildung 4), RSV-infizierten BEAS-2B-Zellen (Abbildung 3, Abbildung 5) und primären Drosophila-Larvenneuronen (Abbildung 6, Abbildung 7), auf gemusterte EM-Gitter für eine optimale Kryo-ET-Datenerfassung zu säen. HeLa-Zellen, die auf mikrostrukturierte TEM-Gitter gesät werden, bleiben lebensfähig, wie durch fluoreszierende Färbung mit einem Calcein-AM- und Ethidium-Homodimer-1-basierten Zelllebensfähigkeitstest bestimmt (Abbildung 4A, B). Mit einem gemischten ECM aus Kollagen und Fibrinogen haften HeLa-Zellen leicht an Mustern im gesamten Gitter (Abbildung 4A, C). Die Gesamtmorphologie von Zellen, die sich entlang des Musters ausdehnen, ähnelt der von Zellen, die auf ungemusterten Gittern gezüchtet wurden (Abbildung 4C,D). Im Falle von HeLa-Zellen bleibt die Gesamtzelldicke ~< 10 μm mit deutlich dünneren Bereichen ~< 1 μm dick in der Nähe der Zellperipherie (Abbildung 4E,F). Für RSV-Studien haben wir ganze Gitterquadrate mit einem Gradienten strukturiert, mit einer niedrig dosierten Exposition an den Rändern und einem höheren Dosismuster in Richtung Zentrum (Abbildung 3A). Gradientenmuster lieferten bessere Ergebnisse bei der Suche nach freigesetzten Viren, die in der Nähe der Peripherie von Zellen vorhanden sind. Mit diesen Mustern wurde festgestellt, dass Zellen bevorzugt an der höheren ECM-Konzentration haften, aber auch in der Lage sind, an den niedrigeren ECM-Konzentrationen zu haften und zu wachsen. Die relative Dosis zwischen den Bereichen muss optimiert werden, wenn Muster verwendet werden, die mehrere Dosen erfordern. Wenn die Dosen und damit die ECM-Konzentrationen zu ähnlich oder zu unterschiedlich zueinander sind, geht der Effekt der Verwendung mehrerer Dosen verloren. In Abbildung 3 wurde ein TEM-Gitter gemustert und anschließend mit RSV-infizierten BEAS-2B-Zellen ausgesät und für die Kryo-EM-Datenerfassung verwendet. Abbildung 4A ist ein fluoreszierendes Bild von ECM, das unter Verwendung eines Gradientenmusters auf ein TEM-Gitter gemustert ist. Zelladhäsion und -wachstum entlang der zentralen Region des Musters sind in Abbildung 3B als Hellfeldbild der Zellen 18 Stunden nach dem Seeding zu sehen. In Abbildung 3C wird das Fluoreszenzsignal (rot) aus der Replikation von RSV-A2mK+ mit dem Signal des ECM überlagert. Die Mehrheit der infizierten Zellen befindet sich entlang des zentralen Bereichs mit höherer Dichte des Gradientenmusters. Eine Low-Mag-TEM-Karte des Gitters nach der Kryofixierung zeigt eine Reihe von Zellen, einschließlich RSV-infizierter Zellen, die auf der Kohlenstofffolie in der Nähe der Mitte der Gitterquadrate positioniert sind. Wie bereits für Zellen gezeigt, die auf Standard-TEM-Gittern gezüchtet wurden22, wurden Tilt-Serien von RSV-Virionen in unmittelbarer Nähe zur Peripherie infizierter BEAS-2B-Zellen, die auf mikrostrukturierten Gittern gezüchtet wurden, lokalisiert und gesammelt (Abbildung 5A,B). Viele der RSV-Strukturproteine können in den Tomogrammen identifiziert werden, einschließlich Nukleokapsid (N) und des viralen Fusionsproteins (F) (Abbildung 5C, blaue bzw. rote Pfeile). Für primäre Drosophila-Neuronenstudien wurde festgestellt, dass das schmale Muster in der Nähe der von der Software angebotenen Auflösungsgrenze (wo die Dicke des Musters 2 μm betrug) es ermöglichte, von einer bis zu wenigen Zellen innerhalb eines Gitterquadrats isoliert zu werden (Abbildung 6). Das neuronale Soma konnte seine Neuriten über einen Zeitraum von mehreren Tagen innerhalb des Musters ausdehnen. Dies ermöglichte eine einfache Identifizierung und Neigungsreihenerfassung der Neuriten im Vergleich zu Neuronen, die auf ungemusterten Gittern kultiviert wurden (Abbildung 7). Es wurde auch festgestellt, dass fluoreszenzmarkiertes Concanavalin A, ein Lektin, das als ECM für in vitro Drosophila-Neuronale Kulturen verwendet wurde20,21, für die Musterung geeignet ist. Drosophila-Neuronen aus Larven des dritten Stadiums wurden nach zuvor veröffentlichten Protokollen isoliert20,21,31. Die neuronalen Präparate wurden auf mikrostrukturierte Kryo-EM-Gitter aufgetragen, in denen Concanavalin A auf dem Muster abgelagert wurde, um die Platzierung, Ausbreitung und Organisation von Zellen zu regulieren. Die Neuronen auf gemusterten oder ungemusterten Gittern durften für mindestens 48-72 Stunden inkubieren, und die Gitter wurden dann eingefroren. Ein repräsentatives Bild eines mikrostrukturierten EM-Gitters mit mehreren Drosophila-Neuronen, die über die gemusterten Regionen verteilt sind, ist in Abbildung 6A dargestellt. Diese Neuronen, die von einem transgenen Fliegenstamm mit pannononaler GFP-Expression in der Membran abgeleitet sind, können nicht nur aufgrund ihrer fluoreszierenden Markierung, sondern auch aufgrund ihrer Lage innerhalb der Mikromuster leicht durch Lichtmikroskopie verfolgt werden. Während Neuronen, die auf ungemusterten Gittern kultiviert wurden, auch durch ihre GFP-Signalisierung durch Lichtmikroskopie verfolgt werden können (Abbildung 7A, gelber Kreis), wurde die Lokalisierung in Kryo-EM aufgrund des Vorhandenseins von Zelltrümmern und Kontamination durch die Medien wesentlich schwieriger (Abbildung 7B, gelber Kreis). Eine solche Präsenz wurde für Neuronen auf gemusterten Gittern verringert, wahrscheinlich aufgrund der PEG in der Anti-Fouling-Schicht der nicht gemusterten Regionen, die die Zelltrümmer vom Anhaften abstößten. Aufgrund der Abmessungen des Neuronenzellkörpers und der ausgedehnten Neuriten (Abbildung 6A,B, gelber Kreis) wurden Kryo-ET-Neigungsreihen entlang dünnerer Regionen der Zellen gesammelt (Abbildung 6C,D, roter Kreis). Die neuronale Zellmembran, ein Mitochondrium (Cyan), Mikrotubuli (lila), Aktinfilamente (blau), vesikuläre Strukturen (orange und grün) und Makromoleküle wie Ribosomen (rot) wurden in Bildmontagen mit höherer Vergrößerung und Schnitten durch das 3D-Tomogramm gut aufgelöst (Abbildung 6E). Während ähnliche subzelluläre Merkmale aus 3D-Tomogrammen ungemusterter Neuronen zu sehen sind (Abbildung 7E), verringerte die Schwierigkeit, lebensfähige zelluläre Ziele für die Datenerfassung zu finden, den Durchsatz erheblich. In Abbildung 8 wurden repräsentative Bilder aus Rastern mit einigen dieser Probleme zusammengestellt, um deren Identifizierung und Fehlerbehebung zu unterstützen. Sobald optimale Bedingungen bestimmt sind, ist die Mikrostrukturierung eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Positionierung von Zellen auf Gittern für Kryo-TEM. Abbildung 1: Allgemeiner Arbeitsablauf der Mikrostrukturierung für Kryo-EM. Der Workflow lässt sich grob in vier Teile unterteilen: Grid-Vorbereitung, Mikrostrukturierung, ECM und Cell Seeding sowie Kryovorbereitung und Datenerfassung. Die wichtigsten Schritte jedes Abschnitts sind unter den Überschriften aufgeführt, und die ungefähre Zeit bis zum Abschließen der einzelnen Abschnitte wird links angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Screenshot der Software mit auf dem Raster positioniertem Muster. Bereich 1 enthält das μm/pix-Verhältnis für das Musterdesign. Bereich 2 ist das Lineal für die Messung eines Gitters. Bereich 3 ist der Ort, an dem Muster und ROIs hinzugefügt oder geändert werden können. Bereich 4 enthält alle Informationen zur Musterpositionierung und Dosis. Bereich 5 enthält Optionen für Muster, einschließlich umschalten von Überlagerungen, Kopieren oder Löschen von Mustern und Auswählen von Mustern für die Mikrostrukturierung. In Bereich 6 können Vorlagen gespeichert und geladen werden. Größere Ansichten der Bereiche 4 und 5 sind unten aus Gründen der Übersichtlichkeit dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: RSV-infizierte BEAS-2B-Zellen auf dem gemusterten Kryo-TEM-Gitter. (A) Fluoreszierendes Bild des gemusterten Gitters nach Zugabe von fluoreszierend markiertem ECM. Das Eingabemuster wird in der unteren linken Ecke angezeigt. (B) Hellfeldbild von BEAS-2B-Zellen, die auf dem Gitter in A gezüchtet wurden. (C) Verschmelzung des Bildes in A (Cyan) und B (grau) mit fluoreszierendem Bild von RSV-infizierten Zellen (rot) unmittelbar vor dem Einfrieren; infizierte Zellen exprimieren mKate-2. Maßstabsbalken sind 500 μm. (D) Kryo-TEM-Karte des Gitters in B mit geringer Vergrößerung nach Dem Einfrieren. Fluoreszierende Bilder sind pseudofarbig. Maßstabsbalken sind 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Lebende/tote Färbung von gemusterten und ungemusterten Zellen. (A) Fluoreszierendes Bild von HeLa-Zellen, die auf einem gemusterten Gitter gezüchtet und mit Calcein-AM (Lebendzellfärbung, grün) und Ethidium homodimer-1 (tote Zellfärbung, rot) gefärbt wurden. (B) HeLa-Zellen, die auf einem ungemusterten Gitter gezüchtet und wie in A gefärbt wurden. (C) Projektion konfokaler Z-Stacks einer HeLa-Zelle auf einem gemusterten Quantifoil R2/2-Gitter mit 0,01 mg/ml Kollagen und Fibrinogen 647 ECM (rot). Die Zelle wurde mit Calcein-AM (grün) und Hoechst-33342 (blau) gefärbt. (D) HeLa-Zellen auf ungemustertem Gitter, inkubiert mit 0,01 mg/ml Kollagen und Fibrinogen 647 ECM, inkubiert und mit Calcein-AM und Hoecsht-33342 gefärbt. Die fluoreszierenden Bilder wurden mit Durchlicht (Graustufen) verschmolzen. (E) X,Z Projektion von C. (F) X,Z Projektion von D. Bilder sind pseudogefärbt. Maßstabsbalken in (A) und (B) sind 500 μm; Maßstabsbalken in (C) – (F) sind 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Cryo-ET der RSV-infizierten BEAS-2B-Zelle auf dem gemusterten Kryo-TEM-Gitter. (A) Quadratische Kryo-EM-Gitterkarte der RSV-infizierten BEAS-2B-Zelle. Die ungefähre Zellgrenze wird durch die gestrichelte grüne Linie angezeigt. (B) Bild mit höherer Auflösung des Bereichs, der in (A) rot eingerahmt ist. Die ungefähre Zellgrenze wird durch eine gestrichelte grüne Linie angezeigt. RSV-Virionen sind in der Nähe der Zellperipherie zu sehen (weißer Pfeil und gelber Kasten). C) Einzelne z-Scheibe aus dem Tomogramm, die im Bereich des gelben Feldes in Buchstabe B gesammelt wurde. Rote Pfeile zeigen auf das FUSIONSPROTEIN RSV F, blaue Pfeile auf den Ribonukleoproteinkomplex (RNP). Die Maßstabsbalken in (A)-(C) sind in das Bild eingebettet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Primäre Neuronen, die aus den Gehirnen der 3. Drosophila melanogaster Larven auf dem gemusterten Kryo-TEM-Gitter stammen. (A) Überlagerte Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie-Gittermontage von Drosophila-Neuronen , die membranzielte GFP auf gemusterten Gitterquadraten mit 0,5 mg/ml fluoreszierendem Concanavalin exprimieren A. Grün: Drosophila-Neuronen . Blau: Photomuster. (B) Kryo-EM-Bildmontage des Gitters in (A) nach Kryokonservierung. Der gelbe Kreis zeigt das gleiche Gitterquadrat wie in (A). (C) Kryo-EM-Bildmontage des Quadrats, das durch den gelben Kreis in (A) und (B) hervorgehoben wird. (D) Bild mit höherer Vergrößerung des Bereichs, der durch den roten Kreis in (C) begrenzt wird, wo eine Neigungsreihe auf den Neuriten der Zelle gesammelt wurde. E. 25 nm dicke Scheibe eines Tomogramms, rekonstruiert aus der Neigungsreihe, die aus dem roten Kreis in (C) aufgenommen wurde. Verschiedene Organellen können in diesem Tomogramm gesehen werden, wie die Mitochondrien (Cyan), Mikrotubuli (lila), dichte Kernvesikel (orange), helle Vesikel (grün), das endoplasmatische Retikulum (gelb) und Aktin (blau). Makromoleküle, wie Ribosomen (rot), sind auch in der oberen rechten Ecke zu sehen. Fluoreszierende Bilder sind pseudofarbig. Die Maßstabsbalken in (A)-(E) sind in das Bild eingebettet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: Primäre Neuronen, die aus den Gehirnen der 3. Drosophila melanogaster Larven auf ungemusterten Gittern stammen. (A) Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie-Gittermontage von Drosophila-Neuronen , die membranzielte GFP auf Gitterquadraten mit 0,5 mg/ml Concanavalin exprimieren A. Grün: Drosophila-Neuronen . (B) Kryo-EM-Gittermontage desselben Gitters in (A) nach Dem Einfrieren. Gelber Kreis zeigt das gleiche Gitterquadrat wie in (A). Beachten Sie das Vorhandensein von Zelltrümmern und Medienverunreinigungen, die die Zielidentifizierung im Vergleich zu gemusterten Gittern erschwerten. (C) Kryo-EM-Bildmontage des Quadrats, hervorgehoben durch die gelben Kreise in den (A) und (B) Karten. (D) Bild mit höherer Vergrößerung des Bereichs, der durch den roten Kreis in (C) begrenzt wird, wo eine Neigungsreihe auf den Neuriten der Zelle gesammelt wurde. (E) 25 nm dicke Scheibe des rekonstruierten Tomogramms aus der Neigungsreihe von (C) und (D). Eine Reihe von Organellen sind in diesem Tomogramm sichtbar, wie Mikrotubuli (lila), Aktin (blau), das endoplasmatische Retikulum (gelb) und dichte Kernvesikel (orange). Makromoleküle, wie Ribosomen (rot), können ebenfalls gesehen werden. Fluoreszierende Bilder sind pseudofarbig. Die Maßstabsbalken in (A)-(E) sind in das Bild eingebettet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8: Beispiele für mögliche Probleme mit der Musterung. Fluoreszierende Bilder von markiertem ECM, die auf mikrogemusterten Gittern abgeschieden sind. (A) Ungleichmäßige Musterung über das Gitter aufgrund der ungleichmäßigen Verteilung von PLPP-Gel. (B) ECM kann sich während der Musterung nicht an Bereiche halten, die von der PDMS-Schablone abgedeckt werden. (C) Gesättigtes Verlaufsmuster (rechte Seite) oder invertiertes Muster (links) auf einem Gitter mit zu hoher Gesamtdosis. (D) ECM haftet sowohl an Bereichen auf den Gitterbalken als auch an gemusterten Bereichen aufgrund von Reflexionen des UV-Lasers während der Musterung. Bilder sind pseudokoloriert; Das Eingabemuster wird unten links angezeigt. Maßstabsbalken sind 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ausstellen Mögliche Ursache(n) Fehlerbehebung Mikrostrukturierung Beleuchtung durch PRIMO-Laser kann nicht angezeigt werden • Lichtweg ist nicht korrekt eingerichtet • Überprüfen Sie, ob der Lichtweg des Mikroskops richtig eingestellt ist • PRIMO-Laser ist nicht eingeschaltet oder Der Laser ist ineinander verriegelt Viele gebrochene Gitterquadrate • Berühren von Gitterfolie mit Pinzette oder Pipette während der Handhabung • Behandeln Sie Gitter mit Sorgfalt • Gitter während der Inkubation oder beim Waschen ausgetrocknet • Lassen Sie das Gitter während des Waschens und Inkubierens nicht trocknen Große ungemusterte Bereiche • Unzureichende Gelabdeckung • Sorgen Sie dafür, dass sich das Gel gleichmäßig über das Gitter verteilt, während Sie es hinzufügen • Gitterfolie während der Musterung unscharf • Fügen Sie einen zusätzlichen Mikroliter Gel hinzu •Von Schablonen bedeckte Fläche • Überprüfen Sie den Fokus, bevor Sie jede Region strukturieren • Gitter sorgfältig in Schablone zentrieren Gesättigtes oder invertiertes Muster • Falsche Dosis • Probieren Sie eine Reihe von Gesamtdosen für Muster aus • Unzureichende Gelabdeckung • Stellen Sie sicher, dass das Gitter gleichmäßig mit Gel bedeckt ist • Probieren Sie verschiedene Werte für Graustufenmuster aus Verschwommenes Muster • Schlechter Fokus bei der Musterung • Wiederholen Sie die PRIMO-Kalibrierung auf gleicher Höhe wie die Probe • Falsche Kalibrierung • Konzentrieren Sie sich vor der Musterung auf die Gitterfolie • Teilen Sie das Muster zur Musterung in zusätzliche Bereiche auf ECM haftet außerhalb des Musters • Reflexionen durch Gel oder Staub • Stellen Sie sicher, dass das Gel vor dem Mustern trocken ist • Stellen Sie sicher, dass Deckglas und Objektiv sauber sind ECM nach Musterung nicht sichtbar • Fotobleiche • Minimieren Sie die Lichtexposition gegenüber ECM vor der Bildgebung • Falsche Dosis während der Musterung • Probieren Sie eine Reihe von Gesamtdosiswerten für muster aus • Unzureichende ECM-Inkubationszeit • Erhöhen Sie die Inkubationszeit für ECM Zell-Seeding Verklumpende Zellen • Über verdauung • Verwenden Sie einen geringeren Prozentsatz an Trypsin oder Zeit für die Freisetzung von adhärenten Zellen • Hohe Zelldichte • Passage und/oder Verdauung von Zellen bei geringerer Konfluenz • Rühren Sie die Zellen während der Freisetzung nicht • Pipettieren Sie sanft Zelllösung oder verwenden Sie Zellsiebe Zellen, die nicht an gemusterten Bereichen haften • ECM ist nicht für Zelltyp geeignet • Probieren Sie verschiedene ECM-Konzentrationen und Zusammensetzungen aus • Die Lebensfähigkeit der Zellen wird vor der Aussaat verringert • Stellen Sie sicher, dass Die Zellkultur und die Zellfreisetzungsbedingungen die Zellen nicht schädigen Zellen, die sich nach der Adhäsion nicht ausdehnen • ECM oder Muster nicht für Zelltyp geeignet • Probieren Sie verschiedene Muster und ECM aus • In einigen Fällen kann eine kontinuierlichere Folie (R1.2/20 vs R2/1) die Zellexpansion fördern Tabelle 1: Mögliche Probleme während der Mikrostrukturierung. In dieser Tabelle werden einige Probleme beschrieben, die bei einem Benutzer beim Mikromustern oder Cell-Seeding auftreten können. Mögliche Ursachen und Fehlerbehebung werden für jedes Problem bereitgestellt. Repräsentative Bilder einiger Probleme sind in Abbildung 8 zu sehen.

Discussion

Moderne, fortschrittliche Elektronenmikroskope und Softwarepakete unterstützen jetzt eine optimierte automatisierte Kryo-EM- und Kryo-ET-Datenerfassung, bei der Hunderte bis Tausende von Positionen innerhalb weniger Tage anvisiert und abgebildet werden können32,33,34,35. Ein wesentlicher limitierender Faktor für ganzzellige Kryo-ET-Workflows war die Erzielung einer ausreichenden Anzahl sammelbarer Ziele pro Raster. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Gruppen Protokolle für Mikrostrukturierungsgitter für Kryo-EM entwickelt, wobei ein Vorteil eine verbesserte Datenerfassungseffizienz ist16,17,18. Hier wird ein Protokoll zur Verwendung eines kommerziell erhältlichen Mikrostrukturierungssystems zur Mikrostrukturierung von TEM-Gittern für Kryo-ET-Studien an primären Drosophila-Neuronen und kultivierten menschlichen Zelllinien (nicht infiziert oder RSV-infiziert) vorgestellt. Dieses Mikrostrukturierungssystem ist vielseitig und viele Schritte können optimiert und auf spezifische experimentelle Ziele zugeschnitten werden. Ein Benutzer mit Erfahrung in der TEM- und Fluoreszenzmikroskopie kann sich schnell mit der Netzvorbereitung und mikrostrukturierung vertraut machen. Bei sorgfältiger Übung sollten gute Ergebnisse nach einigen Iterationen erreichbar sein. Im Folgenden werden einige der verfügbaren Optionen, Benutzerüberlegungen, potenziellen Vorteile und zukünftigen Anwendungen der Mikrostrukturierung für Kryo-EM diskutiert.

Eine der wichtigen Überlegungen für die Kryo-ET der ganzen Zelle ist die Auswahl des EM-Gitters. EM-Gitter bestehen aus zwei Teilen: einem Netzrahmen (oder einer strukturellen Unterstützung) und der Folie (oder Folie), die die kontinuierliche oder löchrige Filmoberfläche ist, auf der Zellen wachsen. Kupfergeflechtgitter werden häufig für Kryo-EM von Proteinen und isolierten Komplexen verwendet. Sie sind jedoch aufgrund der Zytotoxizität von Kupfer für ganzzellige Kryo-ET ungeeignet. Stattdessen wird häufig ein Goldnetz für die Zelltomographie verwendet. Andere Optionen umfassen Nickel oder Titan, die Vorteile gegenüber Gold bieten können, wie z.B. erhöhte Steifigkeit16. EM-Gitter sind mit unterschiedlichen Maschenweiten erhältlich, um eine Reihe von Anwendungen zu unterstützen. Größere Maschenweiten bieten mehr Platz für Zellen, um zwischen Gitterstäben und mehr Bereichen zu wachsen, die für die Sammlung von Kippreihen zugänglich sind, wenn auch auf Kosten einer erhöhten Gesamtbrüchigkeit der Proben. Die am häufigsten verwendete Folie ist perforierter oder löchriger amorpher Kohlenstoff, wie Quantifoils oder C-Flat-Gitter. Biologische Ziele können entweder durch die Löcher im Kohlenstoff oder durch den elektronendurchscheinenden Kohlenstoff abgebildet werden. Gitter wie R 2/1 oder R 2/2, bei denen die Bohrungen 2 μm breit sind und 1 bzw. 2 μm voneinander entfernt sind, bieten eine große Anzahl von Löchern und damit eine große Anzahl potenzieller Bereiche für die Datenerfassung. Einige Zellen können jedoch auf gleichmäßigeren Oberflächen wie R 1,2/20-Gittern oder kontinuierlichem Kohlenstoff besser wachsen und sich ausdehnen. Bei der nachgeschalteten Probenbearbeitung durch fokussiertes Ionenstrahlfräsen (Cryo-FIB) wird die Folie durch Fräsen entfernt, wodurch Bedenken hinsichtlich des fortgesetzten Vorhandenseins der darunter liegenden Folie verringert werden. Wie beim Mesh sind auch Folien aus anderen Materialien erhältlich, wobei das hier vorgestellte Patterning-Protokoll auch für SiO2-Gitter geeignet ist. Zu den häufig verwendeten Gittern gehören Gold-Quantifoil-, kontinuierliche Kohlenstoff- oder SiO2-Film-200-Mesh-Gitter (~ 90 μm Abstand zwischen Gitterbalken) für Ganzzell-Kryo-ET.

Beim Entwerfen eines Musters gibt es eine Reihe von Überlegungen. Ein Großteil dieser Entscheidungen richtet sich nach dem Zelltyp und dem Zweck des Experiments. Ein guter Ausgangspunkt ist es, ein Muster zu wählen, das sich der Form und den Abmessungen der Zellen in Kultur annähert. Viele Studien haben signifikante Auswirkungen der Musterform auf das Zellwachstum und die Zytoskelettanordnung gezeigt13,36,37. Besondere Vorsicht ist bei der Mustergestaltung geboten, wenn dies das gewünschte Ziel verändern könnte. Mehrere Muster für jeden Zelltyp wurden getestet, um festzustellen, welche Muster die zelluläre Adhäsion und das Wachstum förderten. Die Flexibilität des Mikrostrukturierungssystems ermöglicht das Testen mehrerer Muster auf einem einzigen Raster und das Ändern von Mustern für verschiedene Gitter innerhalb eines einzigen Experiments. Größere Muster (~50-90 μm), wie sie hier verwendet werden, erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Zellen an einem einzigen Bereich des Musters haften und es den Zellen ermöglichen, sich nach der Adhäsion auszudehnen und auszudehnen. Eingeschränktere Muster (20-30 μm) können in Experimenten geeignet sein, bei denen die Zellisolation kritischer ist als die Zellexpansion, z. B. für Experimente mit fokussiertem Ionenstrahlmahlen (Cryo-FIB). Für Tomographie-Anwendungen muss man möglicherweise den Einfluss der Neigungsachse berücksichtigen. Wenn ein Muster so positioniert ist, dass alle Zellen parallel zueinander in einer Richtung wachsen, ist es möglich, dass alle Zellen senkrecht zur Kippachse stehen, wenn sie auf das Mikroskoptisch geladen werden, was zu einer geringeren Datenqualität führt.

Auf ungemusterten Gittern haften Zellen oft bevorzugt an den Gitterbalken, wo sie von TEM nicht abgebildet werden können. Selbst auf gemusterten Gittern wird oft beobachtet, dass Zellen in den Ecken von Gitterquadraten positioniert sind, teilweise sowohl auf der gemusterten Kohlenstofffolie als auch auf dem Gitterbalken. Kürzlich wurde Mikrostrukturierung verwendet, um einen Teil der Zelle absichtlich über der Gitterleiste zu positionieren18. Dies könnte für Experimente in Betracht gezogen werden, bei denen es nicht entscheidend ist, die gesamte Zellperipherie auf der Folie zu haben. Dies kann besonders wichtig für Zellen sein, die größer als ein einzelnes Gitterquadrat wachsen können, wie z. B. primäre Neuronen, die über mehrere Tage wachsen.

Es gibt viele Werkzeuge, die verwendet werden können, um ein Muster zu entwerfen. Hier wurde das Muster auf weniger als 800 Pixel in jeder Dimension beschränkt, so dass das Muster in jeden Winkel gedreht werden kann und immer noch in den maximalen Bereich passt, der in einer einzigen Projektion durch dieses Mikrostrukturierungssystem gemustert werden kann. Dies ermöglicht es dem Benutzer, das Muster so zu drehen, dass es unabhängig von der Ausrichtung des Gitters auf dem Mikroskop richtig mit dem Gitter ausgerichtet ist. Hier wurde das Raster in sechs Musterbereiche unterteilt. In erster Linie ermöglicht dies eine Fokusanpassung zwischen verschiedenen Regionen des Rasters. Insbesondere Goldgitter sind sehr formbar und dürfen sich nicht ganz flach auf das Glas legen. Der richtige Fokus ist für saubere, verfeinerte Musterergebnisse unerlässlich. Durch die Verwendung von segmentierten Mustern müssen nur geringfügige Anpassungen an der Musterposition vorgenommen werden, wenn sich das Gitter während des Strukturierungsprozesses leicht verschiebt, obwohl dies bei der Verwendung des PLPP-Gels mit den PDMS-Schablonen normalerweise kein Problem darstellt. Schließlich blieben die zentralen vier Gitterquadrate des Rasters ungemustert. Dies unterstützt einen Benutzer in der Lage, die Mitte des Gitters eindeutig zu identifizieren, was für korrelative Bildgebungsexperimente sehr nützlich ist.

Die Strukturierungssoftware für dieses Mikrostrukturierungssystem, Leonardo, verfügt auch über erweiterte Funktionen wie Stitching und die Möglichkeit, Muster als PDFs zu importieren, die über den Rahmen dieses Protokolls hinausgehen. Diese Software umfasst auch die Erkennung von Mikrostrukturen und die automatisierte Musterpositionierung, die auf TEM-Gittern verwendet werden können. Diese Funktion ist am nützlichsten, wenn das Raster sehr flach ist und gemustert werden kann, ohne dass der Fokus zwischen verschiedenen Bereichen angepasst werden muss.

Die Auswahl eines ECM-Proteins kann einen signifikanten Einfluss auf die Zelladhäsion und -ausdehnung haben. Es ist bekannt, dass einige Zellen physiologische Veränderungen erfahren, wenn sie auf bestimmten Substraten gezüchtet werden38. Mehrere ECM-Proteine und -Konzentrationen wurden für jeden neuen Zelltyp getestet, basierend auf früheren Arbeiten, die in der Literatur berichtet wurden. Laminin, Fibrinogen, Fibronektin und Kollagen werden häufig für kultivierte Zellen verwendet und können als Ausgangspunkt verwendet werden, wenn keine anderen Daten verfügbar sind. Es müssen jedoch auch andere ECM-Proteine berücksichtigt werden, wenn die häufig verwendeten ECM-Proteine den Zellen keine angemessenen Adhärenzeigenschaften verleihen. Dies galt insbesondere für primäre Drosophila-Neuronen , da eine hohe Konzentration des pflanzlichen Lektins Concanavalin A für eine ordnungsgemäße zelluläre Adhärenz notwendig war. Die Kompatibilität der zellulären Adhäsion und des Wachstums mit dem ECM kann durch Musterung auf Glasschalen oder Objektträgern vor dem Übergang zu TEM-Gittern getestet werden. Dieser Pre-Screening-Ansatz ist zeit- und kosteneffizient, wenn eine große Anzahl von Kombinationen untersucht werden muss. Die Einbeziehung eines fluoreszenzkonjugierten ECM-Proteins ist wertvoll, um den Erfolg und die Qualität der Musterung zu beurteilen.

Cell Seeding ist einer der wichtigsten Schritte für ganzzellige Kryo-ET, entweder mit oder ohne Mikrostrukturierung6,16,39. Für primäre Drosophila oder andere Neuronen, die zerbrechlich, instabil in der Suspension und in der Menge begrenzt sein können, werden einzelne Seeding-Ansätze gegenüber überwachter, sequentieller Zellsaat bevorzugt. Ein einzelner Seeding-Schritt bei einer optimierten Zelldichte, wie im Protokoll für Drosophila-Neuronen beschrieben, ist für die meisten Zelltypen eine praktikable Option. Es ist aber auch möglich, Zellen in einer geringeren Ausgangskonzentration auf das Substrat zu säen und mehr Zellen überwacht hinzuzufügen, wie hier und in anderer Literatur18 beschrieben. Dieses sequenzielle Seeding kann in einigen Fällen konsistentere Ergebnisse liefern. Ähnlich wie bei der Standardzellkultur sollte immer darauf geachtet werden, die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die Zellverklumpung während der Isolierung zu minimieren.

Wenn Sie zum ersten Mal mit dem Mikromustern beginnen, gibt es einige potenzielle Fallstricke, die sich nachteilig auf das Endergebnis auswirken. Sorgfältige Gitterhandhabung und sterile Technik, eine gleichmäßige Verteilung des PLPP-Gels, die richtige Dosis und Fokussierung während der Strukturierung sowie die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit vor der Aussaat gehören zu den wichtigsten Überlegungen für den Erfolg. Eine Liste einiger der potenziellen Probleme sowie Lösungen wurde in Tabelle 1 zusammengestellt.

Mikrostrukturierte Gitter können verwendet werden, um Zellen zu positionieren, um eine konsistente Zelldichte über das Gitter hinweg herzustellen und interessante Bereiche in Bereichen zu positionieren, die für die Sammlung von Neigungsreihen geeignet sind16,18. Die Platzierung und Positionierung von Zellen kann als fiduziale Marker für die Korrelation in Kryo-CLEM-Experimenten verwendet werden, wodurch der Bedarf an fragilen Suchergittern und fluoreszierenden Fiducialmarkern reduziert wird. Es sollte jedoch beachtet werden, dass solche fiduzialen Marker für die Submikrometer-Genauigkeitskorrelation immer noch nützlich sein können29,40. Darüber hinaus ist eine gleichmäßige Verteilung isolierter Zellen auch für Kryo-FIB-Experimente (Focused-Ion Beam Milling) von großem Nutzen, um die Anzahl der Zellen zu maximieren, aus denen Lamellen geschnitten werden können16.

Die Hinzufügung von Mikromustern zu Kryo-EM-Workflows wird zu messbaren Verbesserungen des Datendurchsatzes führen und möglicherweise neue Experimente ermöglichen. Mit der weiteren Einführung und Entwicklung der Technik werden fortschrittlichere Anwendungen der Mikrostrukturierung, einschließlich ECM-Gradienten, mehrerer ECM-Ablagerungen und Mikrostrukturmontage, die Fähigkeiten von Kryo-ET zur Untersuchung biologischer Ziele und Prozesse im vollständigen zellulären Kontext weiter ausbauen.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang und Frau Josephine W. Mitchell vom Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison für die großzügige gemeinsame Nutzung der elav-Gal4, UAS-CD8::GFP Fly Strain (Bloomington Stock Center, #5146). Wir danken auch Dr. Aurélien Duboin, Herrn Laurent Siquier und Frau Marie-Charlotte Manus von Alvéole und Herrn Serge Kaddoura von Nanoscale Labs für ihre großzügige Unterstützung während dieses Projekts. Diese Arbeit wurde zum Teil von der University of Wisconsin, Madison, dem Department of Biochemistry an der University of Wisconsin, Madison, und den Zuschüssen des öffentlichen Gesundheitswesens R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 und U24 GM139168 an E.R.W. und R01 AI150475 an P.W.S. vom NIH unterstützt. Ein Teil dieser Forschung wurde durch den NIH-Zuschuss U24 GM129547 unterstützt und am PNCC an der OHSU durchgeführt und über EMSL (grid.436923.9), eine vom Office of Biological and Environmental Research gesponserte DOE Office of Science User Facility, zugänglich gemacht. Wir sind auch dankbar für den Einsatz von Einrichtungen und Instrumenten am Cryo-EM Research Center in der Abteilung für Biochemie an der University of Wisconsin, Madison.

Materials

0.1% (w/v) Poly-L-Lysine Sigma P8920-100ML
0.22 µm syringe filters PVDF membrane Genesee 25-240
22×60-1 Glass cover slip Fisher 12545F
5/15 Tweezers EMS (Dumont) 0203-5/15-PO
Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher (Gibco) 15240096
BEAS-2B cells ATCC CRL-9609
Collagen I, bovine ThermoFisher (Gibco) A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) C11254
DMEM Fisher (Lonza) BW12-604F
EtOH Fisher (Decon Labs) 22-032-600
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) F35200
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher (Gibco) 33010018
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-20-C
Glucose VWR 0643-1KG
Grid prep holder EMS 71175-01
HeLa cells ATCC CCL-2
Hemacytometer Fisher (SKC, Inc.) 22600100
HEPES Fisher (ACROS Organics) AC172572500
Hoechst 33342 ThermoFisher (Invitrogen) H3570
Insulin Fisher (Sigma Aldrich) NC0520015
KCl MP Bio 194844
KH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC212595000
Leica-DMi8 Leica Microsystems Can be customized with camera, stage, and objective attachments
Leonardo Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research Grade Fisher (Supply Solutions) 50-100-3280
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit ThermoFisher (Invitrogen) L3224
Microscope camera Hammamatsu C13440-20CU
Motorized stage Märzhäuser Wetzlar 00-24-599-0000
NaCl Fisher (Fisher BioReagents) BP358-1
NaH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC207802500
NaOH Fisher (Alfa Aesar) AAA1603736
PBS Corning 21-040-CV
PDMS stencils nanoscaleLABS PDMS_STENCILS_EM https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVA nanoscaleLABS PEG-SVA-1GR mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000
Penicillin Fisher (Research Products International Corp) 50-213-641
pH strips Fisher (Millipore Sigma) M1095350001 pH probe can also be used
PLPP gel nanoscaleLABS PLPP-GEL-300UL https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMO Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) BEI Resources NR-36460 https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Quantifoil grids EMS (Quantifoil) Q2100AR1 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available
RPMI Fisher (Lonza) BW12-702F
RSV A2-mK+ see entry for pSynkRSV-19F – Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F
Schneider's Media ThermoFisher (Gibco) 21720-024
SerialEM SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Straight tweezers EMS (Dumont) 72812-D
Streptomycin Fisher (Fisher BioReagents) BP910-50
Sucrose Avantor 4097-04
Tetracycline Sigma T8032-10MG
Titan Krios electron microscope ThermoFisher 300kV, with direct electron detector camera and energy filter
Trypsin ThermoFisher (Gibco) 15090046
Tube Revolver/Rotator Fisher (Thermo Scientific) 11676341
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain Bloomington Drosophila Stock Center 5146 http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html
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Referências

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Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows. J. Vis. Exp. (175), e62992, doi:10.3791/62992 (2021).
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