Gehirnorganoid-Erzeugung aus induzierten pluripotenten Stammzellen in hausgemachten Mini-Bioreaktoren
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Hirnorganoiden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Um Gehirnorganoide in großen Mengen und von hoher Qualität zu erhalten, verwenden wir hausgemachte Mini-Bioreaktoren.
Abstract
Das iPSC-abgeleitete Gehirnorganoid ist eine vielversprechende Technologie für die In-vitro-Modellierung der Pathologien des Nervensystems und das Drogenscreening. Diese Technologie ist in letzter Zeit entstanden. Es steckt noch in den Kinderschuhen und hat einige noch ungelöste Einschränkungen. Die derzeitigen Protokolle erlauben es nicht, Organoide konsistent genug für die Entdeckung von Medikamenten und präklinische Studien zu erhalten. Die Reifung von Organoiden kann bis zu einem Jahr dauern, was die Forscher dazu veranlasst, mehrere Differenzierungsprozesse gleichzeitig zu starten. Es verursacht zusätzliche Kosten für das Labor in Bezug auf Platz und Ausstattung. Darüber hinaus haben Hirnorganoide oft eine nekrotische Zone im Zentrum, die an Nährstoff- und Sauerstoffmangel leidet. Daher verwenden die meisten aktuellen Protokolle ein zirkulierendes System für Kulturmedium, um die Ernährung zu verbessern.
Mittlerweile gibt es keine kostengünstigen dynamischen Systeme oder Bioreaktoren für die Organoidkultivierung. Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Gehirnorganoiden in kompakten und kostengünstigen hausgemachten Mini-Bioreaktoren. Dieses Protokoll ermöglicht die Gewinnung hochwertiger Organoide in großen Mengen.
Introduction
Humane iPSC-abgeleitete Modelle werden häufig in den Studien zu neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen verwendet1. In den letzten zehn Jahren ergänzten 3D-Hirngewebemodelle, sogenannte Hirnorganoide, im Wesentlichen traditionelle 2D-neuronale Kulturen2. Die Organoide rekapitulieren bis zu einem gewissen Grad die 3D-Architektur des embryonalen Gehirns und ermöglichen eine präzisere Modellierung. Viele Protokolle werden für die Erzeugung von Organoiden veröffentlicht, die verschiedene Gehirnregionen repräsentieren: Großhirnrinde3,4,5, Kleinhirn6, Mittelhirn, Vorderhirn, Hypothalamus7,8,9und Hippocampus10. Es gab mehrere Beispiele für die Verwendung von Organoiden zur Untersuchung von Erkrankungen des menschlichen Nervensystems11. Außerdem wurden die Organoide in Arzneimittelentdeckungen12 implementiert und in Studien zu Infektionskrankheiten verwendet, einschließlich SARS-Cov-213,14.
Die Hirnorganoide können bis zu mehreren Millimetern Durchmesser erreichen. So kann die innere Zone des Organoids an Hypoxie oder Unterernährung leiden und schließlich nekrotisch werden. Daher umfassen viele Protokolle spezielle Bioreaktoren8,Shaker oder mikrofluidische Systeme15. Diese Geräte benötigen möglicherweise große Mengen teurer Zellkulturmedien. Auch die Kosten für solche Geräte sind in der Regel hoch. Einige Bioreaktoren bestehen aus vielen mechanischen Teilen, die es schwierig machen, sie für die Wiederverwendung zu sterilisieren.
Die meisten Protokolle leiden unter dem “Batch-Effekt”16, der eine signifikante Variabilität zwischen den Organoiden erzeugt, die aus den identischen iPS-Zellen gewonnen werden. Diese Variabilität behindert Drogentests oder präklinische Studien, die Einheitlichkeit erfordern. Die hohe Ausbeute an Organoiden, die ausreicht, um Organoide von einheitlicher Größe auszuwählen, kann dieses Problem teilweise lösen.
Der Zeitfaktor ist ebenfalls ein erhebliches Problem. Matsui et al. (2018) zeigten, dass Gehirnorganoide mindestens sechs Monate benötigen, um die Reife zu erreichen17. Trujillo et al. (2019) zeigten auch, dass elektrophysiologische Aktivität in Organoiden erst nach sechsMonaten der Kultivierung auftrat18. Aufgrund der langen Organoidreifungszeit starten die Forscher oft eine neue Differenzierung, bevor sie die vorherige abschließen. Mehrere parallele Differenzierungsprozesse erfordern zusätzliche Kosten, Ausrüstung und Laborfläche.
Wir haben kürzlich einen Mini-Bioreaktor entwickelt, der hauptsächlich die oben genannten Problemelöst 19. Dieser hausgemachte Bioreaktor besteht aus einer extrem niedrigen Haftung oder einer unbehandelten Petrischale mit einem Kunststoffknopf in der Mitte. Dieser Kunststoffknopf verhindert das Überfüllen von Organoiden und deren Verklebung in der Mitte der Petrischale, die durch die Rotation des Shakers verursacht wird. Dieser Artikel beschreibt, wie dieser kostengünstige und einfache hausgemachte Mini-Bioreaktor die Erzeugung hochwertiger Gehirnorganoide in großen Mengen ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll besteht aus zwei entscheidenden Schritten, die die Erzeugung hochwertiger Organoide einheitlicher Größe ermöglichen. Erstens wachsen die Organoide aus Sphäroiden, die in Zellzahl und Zellreife nahezu identisch sind. Zweitens bieten die selbstgebauten Bioreaktoren jedem Organoid eine einheitliche Umgebung, in der sich Organoide nicht drängen oder zusammenkleben.
Die Zellqualität und der Zustand der Zellreifung sind für die Durchführung des Protokolls unerläss…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium 075-15-2019-1669 des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation (RT-PCR-Analyse) und durch das Stipendium Nr. 19-15-00425 der Russischen Wissenschaftsstiftung (für alle anderen Arbeiten) unterstützt. Die Autoren danken auch Pavel Belikov für seine Hilfe bei der Videobearbeitung. Figuren in der Handschrift wurden mit BioRender.com geschaffen.
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
Referências
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