Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi
Summary
Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.
Abstract
iPSC türevi beyin organoidi, sinir sisteminin patolojilerini ve ilaç taramasını modellemek için umut verici bir teknolojidir. Bu teknoloji son zamanlarda ortaya çıktı. Henüz emekleme aşamasındadır ve henüz çözülmemiş bazı sınırlamaları vardır. Mevcut protokoller organoid elde etmenin ilaç keşfi ve preklinik çalışmalar için yeterince tutarlı olmasına izin vermemektedir. Organoidlerin olgunlaşması bir yıla kadar sürebilir ve araştırmacıları aynı anda birden fazla farklılaşma süreci başlatmaya itebilir. Laboratuvar için alan ve ekipman açısından ek maliyetler getirmektedir. Ek olarak, beyin organoidleri genellikle merkezde besin ve oksijen eksikliğinden muzdarip nekrotik bir bölgeye sahiptir. Bu nedenle, mevcut protokollerin çoğu beslenmeyi iyileştirmek için kültür ortamı için dolaşım sistemi kullanır.
Bu arada organoid yetiştiriciliği için ucuz dinamik sistemler veya biyoreaktörler yoktur. Bu makalede, kompakt ve ucuz ev yapımı mini biyoreaktörlerde beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, büyük miktarlarda yüksek kaliteli organoidlerin elde etmeyi sağlar.
Introduction
İnsan iPSC türevi modeller nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozuklukların çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır1. Son on yılda, beyin organoidleri olarak adlandırılan 3D beyin dokusu modelleri, esasen geleneksel 2D nöronal kültürleri tamamlamıştır2. Organoidler embriyonik beynin 3D mimarisini bir dereceye kadar yeniden kaplar ve daha hassas modellemeye izin verir. Farklı beyin bölgelerini temsil eden organoidlerin üretimi için birçok protokol yayınlanır: serebral korteks3,4,5, beyincik6, orta beyin, forebrain, hipotalamus 7,8,9ve hipokampus10. İnsan sinir sistemi hastalıklarını incelemek için organoid kullanmanın birden fazla örneği olmuştur11. Ayrıca, organoidler ilaç keşiflerinde uygulandı 12 ve SARS-Cov-213 ,14dahil olmak üzere bulaşıcı hastalıkların çalışmalarında kullanıldı.
Beyin organoidlerinin çapı birkaç milimetreye kadar ulaşabilir. Bu nedenle, organoidin iç bölgesi hipoksi veya yetersiz beslenmeden muzdarip olabilir ve sonunda nekrotik hale gelebilir. Bu nedenle, birçok protokol özel biyoreaktörler8, çalkalayıcılar veya mikroakışkan sistemler15içerir. Bu aygıtlar büyük hacimli pahalı hücre kültürü ortamı gerektirebilir. Ayrıca, bu tür ekipmanların maliyeti genellikle yüksektir. Bazı biyoreaktörler, yeniden kullanım için sterilize etmelerini zorlaştıran birçok mekanik parçadan oluşur.
Çoğu protokol “toplu etkiden”muzdariptir 16Özdeş iPSC’lerden elde edilen organoidler arasında önemli değişkenlik oluşturur. Bu değişkenlik, tekdüzelik gerektiren ilaç testlerini veya preklinik çalışmaları engeller. Tekdüze boyutta organoidleri seçecek kadar yüksek organoid verimi bu sorunu kısmen çözebilir.
Zaman faktörü de önemli bir sorundur. Matsui ve ark. (2018) beyin organoidlerinin olgunluğa ulaşmak için en az altı ay gerektirdiğini gösterdi17. Trujillo ve ark. (2019) ayrıca organoidlerde elektrofizyolojik aktivitenin sadece altı aylık ekimden sonra meydana geldiğini göstermiştir18. Uzun organoid olgunlaşma süresi nedeniyle, araştırmacılar genellikle bir öncekini tamamlamadan önce yeni bir farklılaşma başlatırlar. Birden fazla paralel farklılaşma süreci ek masraflar, ekipman ve laboratuvar alanı gerektirir.
Son zamanlarda esas olarak yukarıda belirtilen sorunları çözen bir mini biyoreaktör geliştirdik19. Bu ev yapımı biyoreaktör, merkezinde plastik bir düğme bulunan ultra düşük yapışma veya işlenmemiş Petri kabından oluşur. Bu plastik düğme, çalkalayıcının dönmesinden kaynaklanan Petri kabının merkezinde organoidlerin kalabalıklaşmasını ve tıkanmasını önler. Bu makale, bu ucuz ve basit ev yapımı mini biyoreaktörün büyük miktarlarda yüksek kaliteli beyin organoidleri üretmeye nasıl izin verdiğini açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokol, tek tip boyutta yüksek kaliteli organoidlerin üretilmesine izin vermek için iki önemli adıma sahiptir. İlk olarak, organoidler hücre sayısı ve hücre olgunluğunda neredeyse aynı olan küresellerden büyür. İkincisi, ev yapımı biyoreaktörler her organoide, organoidlerin kalabalıklaşmadığı veya birbirine yapışmadığı tek tip bir ortam sağlar.
Hücre kalitesi ve hücre olgunlaşmasının durumu protokolü gerçekleştirmek için gereklidir. Nöronal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı’ndan 075-15-2019-1669 hibesi (RT-PCR analizi) ve Rusya Bilim Vakfı’ndan 19-15-00425 sayılı hibe ile desteklendi (diğer tüm çalışmalar için). Yazarlar ayrıca Pavel Belikov’a video düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür etti. El yazmasındaki figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
Referências
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
