घर में प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से ब्रेन ऑर्गेनॉइड जनरेशन मिनी बायोरिएक्टर्स
Summary
यहां हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । बड़ी मात्रा में और उच्च गुणवत्ता के मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्राप्त करने के लिए, हम घर में बने मिनी बायोरिएक्टर का उपयोग करते हैं।
Abstract
आईपीएससी से व्युत्पन्न ब्रेन ऑर्गेनॉइड इन विट्रो मॉडलिंग के लिए एक आशाजनक तकनीक है जो तंत्रिका तंत्र और दवा स्क्रीनिंग की विकृतियों को मॉडलिंग करती है । यह तकनीक हाल ही में सामने आई है। यह अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है और कुछ सीमाएं अभी तक अनसुलझी हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल ऑर्गेनॉइड प्राप्त करने की अनुमति नहीं देते हैं जो दवा की खोज और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए पर्याप्त रूप से सुसंगत होते हैं। ऑर्गेनॉइड की परिपक्वता में एक साल तक का समय लग सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को एक साथ कई भेदभाव प्रक्रियाओं को लॉन्च करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है । यह अंतरिक्ष और उपकरणों के मामले में प्रयोगशाला के लिए अतिरिक्त लागत लगाता है । इसके अलावा, मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड में अक्सर केंद्र में एक गल-नाती क्षेत्र होता है, जो पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की कमी से ग्रस्त होता है। इसलिए, अधिकांश वर्तमान प्रोटोकॉल पोषण में सुधार करने के लिए संस्कृति माध्यम के लिए एक परिसंचारी प्रणाली का उपयोग करते हैं।
इस बीच, ऑर्गेनॉइड खेती के लिए कोई सस्ती गतिशील प्रणाली या बायोरिएक्टर नहीं हैं। यह पेपर कॉम्पैक्ट और सस्ती घर में बने मिनी बायोरिएक्टर्स में ब्रेन ऑर्गेनॉइड के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले ऑर्गेनॉइड प्राप्त करने की अनुमति देता है।
Introduction
मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न मॉडल का व्यापक रूप से न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के अध्ययन में उपयोग किया जाता है1। पिछले एक दशक में, 3 डी मस्तिष्क ऊतक मॉडल, तथाकथित मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड, अनिवार्य रूप से पारंपरिक 2D न्यूरोनल संस्कृतियों2 पूरित। ऑर्गेनॉइड कुछ हद तक भ्रूणीय मस्तिष्क के 3 डी वास्तुकला को फिर से रीकैपिटुलेट करते हैं और अधिक सटीक मॉडलिंग की अनुमति देते हैं। विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाले ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी के लिए कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए जाते हैं: सेरेब्रल कॉर्टेक्स3,4,5,सेरिबैलम6,मिडब्रेन, पूर्वाब्रान, हाइपोथैलेमस7,8,9,और हिप्पोकैम्पस10। मानव तंत्रिका तंत्र की बीमारियों का अध्ययन करने के लिए ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने के कई उदाहरणसामनेआए हैं । इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड को दवा खोजों12 में लागू किया गया था और सार्स-कॉव-213, 14सहित संक्रामक रोगों के अध्ययन में उपयोग कियाजाताथा।
मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड व्यास में कई मिलीमीटर तक पहुंच सकते हैं। इसलिए, ऑर्गेनॉइड का आंतरिक क्षेत्र हाइपोक्सिया या कुपोषण से पीड़ित हो सकता है और अंततः परिगलित हो सकता है। इसलिए, कई प्रोटोकॉल में विशेष बायोरिएक्टर8,शेकर्स, या माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम15शामिल हैं। इन उपकरणों महंगी सेल संस्कृति मीडिया की बड़ी मात्रा की आवश्यकता हो सकती है । इसके अलावा, ऐसे उपकरणों की लागत आमतौर पर अधिक होती है। कुछ बायोरिएक्टर में कई यांत्रिक भाग होते हैं जो उन्हें पुन: उपयोग के लिए स्टरलाइज करना मुश्किल बनाते हैं।
अधिकांश प्रोटोकॉल “बैच प्रभाव”16से पीड़ित हैं, जो समान आईपीएससी से प्राप्त ऑर्गेनॉइड के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता उत्पन्न करता है। यह परिवर्तनशीलता दवा परीक्षण या एकरूपता की आवश्यकता वाले प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में बाधा डालती है। एक समान आकार के ऑर्गेनॉइड का चयन करने के लिए पर्याप्त ऑर्गेनॉइड की उच्च उपज आंशिक रूप से इस समस्या को हल कर सकती है।
समय कारक भी एक महत्वपूर्ण समस्या है। मात्सुई एट अल (2018) ने दिखाया कि ब्रेन ऑर्गेनॉइड को परिपक्वता17तक पहुंचने के लिए कम से कम छह महीने की आवश्यकता होती है। ट्रूजिलो एट अल (2019) ने यह भी दर्शाया कि18की खेती के छह महीने बाद ही ऑर्गेनॉइड में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि हुई। लंबे ऑर्गेनॉइड परिपक्वता समय के कारण, शोधकर्ता अक्सर पिछले एक को पूरा करने से पहले नए भेदभाव का शुभारंभ करते हैं। भेदभाव की कई समानांतर प्रक्रियाओं के लिए अतिरिक्त खर्च, उपकरण और प्रयोगशाला स्थान की आवश्यकता होती है।
हमने हाल ही में एक मिनी बायोरिएक्टर विकसित किया है जो मुख्य रूप से19से ऊपर बताई गई समस्याओं का समाधान करता है । इस घर में निर्मित बायोरिएक्टर में केंद्र में प्लास्टिक घुंडी के साथ अल्ट्रा-कम आसंजन या अनुपचारित पेट्री डिश होती है। यह प्लास्टिक घुंडी पेट्री डिश के केंद्र में ऑर्गेनॉइड की भीड़ और उनके कॉन्ट्लुएशन को रोकता है, जो शेकर के रोटेशन के कारण होता है। यह पेपर बताता है कि कैसे यह सस्ती और सरल घर में बने मिनी बायोरिएक्टर बड़ी मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं जो एक समान आकार के उच्च गुणवत्ता वाले ऑर्गेनॉइड के उत्पादन की अनुमति देते हैं। सबसे पहले, ऑर्गेनॉइड स्फेरॉइड से बढ़ते हैं जो सेल नंबर और सेल परिपक्वता में सम…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रूसी संघ (आरटी-पीसीआर विश्लेषण) के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय से अनुदान 075-15-2019-1669 और रूसी विज्ञान फाउंडेशन (अन्य सभी कार्यों के लिए) से अनुदान संख्या 19-15-00425 द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक भी वीडियो संपादन के साथ उनकी मदद के लिए पावेल बेलिकोव का शुक्रिया अदा करते हैं । पांडुलिपि में आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
Referências
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