Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità
Summary
Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l’occlusione venosa retinica utilizzando il bengala rosa e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato dal laser con raccomandazioni per massimizzare la sua riproducibilità in ceppi geneticamente modificati.
Abstract
I modelli murini di occlusione venosa retinica (RVO) sono spesso utilizzati in oftalmologia per studiare il danno ipossico-ischemico nella retina neurale. In questo rapporto, viene fornito un metodo dettagliato che evidenzia i passaggi critici con raccomandazioni per l’ottimizzazione per ottenere tassi di occlusione costantemente efficaci in diversi ceppi di topi geneticamente modificati. Il modello murino RVO consiste principalmente nella somministrazione endovenosa di un colorante fotosensibilizzante seguito da fotocoagulazione laser utilizzando un microscopio di imaging retinico collegato a un laser a guida oftalmica. Tre variabili sono state identificate come determinanti della coerenza dell’occlusione. Regolando il tempo di attesa dopo la somministrazione del bengala rosa e bilanciando la linea di base e l’uscita laser sperimentale, la variabilità tra gli esperimenti può essere limitata e un tasso di successo più elevato di occlusioni raggiunto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le malattie della retina caratterizzate da edema retinico e lesioni ipossico-ischemiche. Inoltre, poiché questo modello induce lesioni vascolari, può anche essere applicato per studiare la neurovascolarizzazione, la morte neuronale e l’infiammazione.
Introduction
L’occlusione venosa retinica (RVO) è una malattia vascolare retinica comune che ha colpito circa 28 milioni di persone in tutto il mondo nel 20151. La RVO porta al declino della vista e alla perdita negli adulti e negli anziani in età lavorativa, rappresentando una malattia pericolosa per la vista in corso che si stima aumenterà nel prossimo decennio. Alcune delle patologie distinte della RVO includono lesioni ipossico-ischemiche, edema retinico, infiammazione e perdita neuronale2. Attualmente, la prima linea di trattamento per questo disturbo è attraverso la somministrazione di inibitori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Mentre il trattamento anti-VEGF ha contribuito a migliorare l’edema retinico, molti pazienti affrontano ancora un declino della vista3. Per comprendere ulteriormente la fisiopatologia di questa malattia e per testare potenziali nuove linee di trattamento, è necessario costituire un protocollo modello murino RVO funzionale e dettagliato per diversi ceppi murini.
I modelli murini sono stati sviluppati implementando lo stesso dispositivo laser utilizzato nei pazienti umani, abbinato a un sistema di imaging scalato alla dimensione corretta per un topo. Questo modello murino di RVO è stato segnalato per la prima volta nel 2007 4 e ulteriormente stabilito da Ebneter e altri 4,5. Alla fine, il modello è stato ottimizzato da Fuma et al. per replicare le manifestazioni cliniche chiave della RVO come l’edema retinico6. Da quando il modello è stato segnalato per la prima volta, molti studi lo hanno impiegato utilizzando la somministrazione di un colorante fotosensibilizzante seguito dalla fotocoagulazione delle principali vene retiniche con un laser. Tuttavia, la quantità e il tipo di colorante che viene somministrato, la potenza del laser e il tempo di esposizione variano significativamente tra gli studi che hanno utilizzato questo metodo. Queste differenze possono spesso portare a una maggiore variabilità nel modello, rendendolo difficile da replicare. Ad oggi, non ci sono studi pubblicati con dettagli specifici sulle potenziali strade per la sua ottimizzazione.
Questo rapporto presenta una metodologia dettagliata del modello murino RVO nel ceppo C57BL/6J e un ceppo knockout endoteliale inducibile da tamoxifene-9 knockout (iEC Casp9KO) con un background C57BL/6J e di rilevanza per la patologia RVO come ceppo di riferimento per un topo geneticamente modificato. Uno studio precedente aveva dimostrato che l’attivazione non apoptotica della caspasi-9 endoteliale istiga l’edema retinico e promuove la morte neuronale8. L’esperienza nell’uso di questo ceppo ha aiutato a determinare e fornire informazioni su potenziali modifiche per personalizzare il modello murino RVO, che può essere applicabile ad altri ceppi geneticamente modificati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello RVO murino fornisce una strada per comprendere ulteriormente la patologia RVO e per testare potenziali terapie. Mentre il modello RVO del mouse è ampiamente utilizzato sul campo, vi è la necessità di un protocollo dettagliato corrente del modello che affronti la sua variabilità e descriva l’ottimizzazione del modello. Qui, forniamo una guida con esempi dall’esperienza su ciò che può essere modificato per ottenere i risultati più coerenti in una coorte di animali da esperimento e fornire dati affidabili….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
Referências
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