Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

As ciências “omics” são caracterizadas pela análise profunda de um conjunto de moléculas, como DNA, RNA, proteínas, peptídeos, metabólitos, etc. Estes conjuntos de dados gerados em larga escala (genômica, transcriômica, proteômica, peptidômica, metabolômica, etc.) revolucionaram a biologia e levaram a uma compreensão avançada dos processos ^biológicos1. O termo peptidomia começou a ser introduzido no início ^{do século XX}, e alguns autores se referem a ele como um ramo da proteômica2. No entanto, a peptidômica possui particularidades distintas, onde o principal interesse é investigar o conteúdo de peptídeos gerados naturalmente durante os processos celulares, bem como a caracterização da atividade biológica dessas ^{moléculas3,4}.

Inicialmente, os estudos de peptídeos bioativos eram restritos aos neuropeptídeos e peptídeos hormonais através da degradação de Edman e radioimunessay. No entanto, essas técnicas não permitem uma análise global, dependendo do isolamento de cada peptídeo em altas concentrações, tempo para a geração de anticorpos, além da possibilidade de reatividade ^cruzada5.

A análise da peptidomia só foi possível após vários avanços na cromatografia líquida acoplado à espectrometria de massa (LC-MS) e projetos de genoma que forneceram pools de dados abrangentes para estudos proteômicos/peptidóticos6,7. Além disso, um protocolo específico de extração de peptídeos para peptidomes precisava ser estabelecido porque os primeiros estudos que analisaram neuropeptídeos globalmente em amostras cerebrais mostraram que a detecção foi afetada pela degradação maciça de proteínas, que ocorrem principalmente neste tecido após 1 min após a morte. A presença desses fragmentos de peptídeo mascarava o sinal de neuropeptídeo e não representava o peptidome in vivo. Esse problema foi resolvido principalmente com a aplicação de inativação de aquecimento rápido de proteases usando irradiação de micro-ondas, o que reduziu drasticamente a presença desses fragmentos de artefato e permitiu não apenas a identificação de fragmentos de neuropeptídeos, mas revelou a presença de um conjunto de peptídeos de proteínas citostómicas, mitocondriais e nucleares, diferentes de degradação6,8,9.

Esses procedimentos metodológicos permitiram uma expansão do peptidome para além dos conhecidos neuropeptídeos, onde centenas de peptídeos intracelulares gerados principalmente pela ação de proteasomes foram identificados em ^leveduras10, ^zebrafish11, tecidos de ^roedores12 e células ^humanas13. Dezenas desses peptídeos intracelulares têm sido extensivamente mostrados com atividades biológicas e farmacológicas14,15. Além disso, esses peptídeos podem ser usados como biomarcadores de doenças e possivelmente ter significância clínica, como demonstrado no fluido cefalorraquidiano de pacientes com aneurisma saccular ^{intracraniano16}.

Atualmente, além da identificação de sequências de peptídeos, é possível através da espectrometria de massa obter dados de quantitação absoluta e relativa. Na quantitação absoluta, os níveis de peptídeos em uma amostra biológica são comparados aos padrões sintéticos, enquanto na quantitação relativa, os níveis de peptídeos são comparados entre duas ou mais ^amostras17. A quantitação relativa pode ser realizada utilizando as seguintes abordagens: 1) “livre de rótulos”¹⁸; 2) rotulagem metabólica in vivo ou 3) rotulagem química. Os dois últimos baseiam-se no uso de formas isotópicas estáveis incorporadas em peptídeos19,20. Na análise sem rótulos, os níveis de peptídeos são estimados considerando a força do sinal (contagem espectral) durante o ^LC-MS18. No entanto, a rotulagem isotópica pode obter níveis relativos mais precisos de peptídeos.

Muitos estudos peptidômicos utilizaram butiratrato de trimetilamônio (TMAB) rotulando reagentes como rotulagem química, e mais recentemente, a metilação redutiva de Aminas (RMA) com formas deutadas e não deuteradas de reagentes de formaldeído e cianoboroiddeto de sódio foram usados11,21,22. No entanto, os rótulos TMAB não estão disponíveis comercialmente, e o processo de síntese é muito trabalhoso. Por outro lado, na RMA, os reagentes estão disponíveis comercialmente, baratos em comparação com outros rótulos, o procedimento é simples de realizar, e os peptídeos rotulados são ^{estáveis23,24}.

O uso de RMA envolve a formação de uma base de Schiff permitindo que os peptídeos reajam com formaldeído, seguido de uma reação de redução através do cianoboroidido. Esta reação causa dimetilação de grupos de amino livres em terminais N e cadeias laterais de lise e monometilados N-terminais prolines. Como os resíduos de prolina são muitas vezes raros no terminal N, praticamente todos os peptídeos com aminas gratuitas no n-terminus são rotulados com dois grupos de metila23,24,25^.