펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

“Omics” 과학은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 대사 산물 등과 같은 분자 세트의 심층 분석을 특징으로 합니다. 이러한 생성된 대규모 데이터 세트(유전체학, 전사학, 프로테오믹스, 펩티도믹스, 메타볼로믹스 등)는 생물학에 혁명을 일으켰으며 생물학적 과정에 대한 고급 이해로 이어졌다¹. 용어 펩티도믹스는 20 ^세기 초에 소개되기 시작하고, 몇몇 저자는 proteomics2의 분기로 그것을 언급했습니다. 그러나, 펩티도믹스는 세포 과정 동안 자연적으로 생성된 펩티드 함량뿐만 아니라 이들 분자의 생물학적 활성의 특성화를 조사하는 것이 주요 관심사인 뚜렷한 특수성을 갖는다^3,4.

처음에, 생리 활성 펩티드 연구는 에드먼 분해 및 방사선 면역을 통해 신경 펩티드와 호르몬 펩티드에 제한되었다. 그러나, 이들 기술은 고농도각 펩티드의 절연에 따라, 항체의 생성을 위한 시간, 교차 반응성 가능성 외에 글로벌 분석을 허용하지 않는다⁵.

펩티도믹스 분석은 프로테오믹스/펩티도^{믹스 연구를 위한} 포괄적인 데이터 풀을 전달한 액체 크로마토그래피 결합 질량 분광법(LC-MS) 및 게놈 프로젝트에서 몇 차례 발전한 후에만 가능하였다^6,7. 더욱이, 펩티돔에 대한 특정 펩티드 추출 프로토콜은 뇌 샘플에서 전 세계적으로 신경펩티드를 분석한 첫 번째 연구결과에 따라 검출이 단백질의 대규모 분해에 의해 영향을 받았기 때문에 확립될 필요가 있었으며, 이는 주로 이 조직에서 발생하며, 이는 사후 1분 후에 주로 발생한다. 이러한 펩티드 단편의 존재는 신경 펩티드 신호를 마스크하고 생체 내펩티돔을 나타내지 않았다. 이 문제는 주로 전자 레인지 조사를 사용하여 프로테아제의 빠른 가열 불활성화의 적용으로 해결되었으며, 이는 이러한 유물 조각의 존재를 크게 감소시키고 신경 펩티드 조각의 식별뿐만 아니라 세포세포, 미토콘드리아 및 핵 단백질의 존재를 드러냈으며, 데그라돔^6,8,9의 다른.

이러한 방법론적 절차는 잘 알려진 신경 펩티드를 넘어 펩티돔의 확장을 허용했으며, 프로테좀의 작용에 의해 주로 생성된 수백 개의 세포내 펩타이드가 효모¹⁰, 제브라피시¹¹, 설치류 조직¹² 및 인간 세포¹³에서 확인되었다. 이러한 세포 내 펩티드의 수십 광범위하게 생물학적 및 약리학적 활동을 모두 가지고 표시되었습니다^14,15. 더욱이, 이들 펩타이드는 질병 바이오마커로 사용될 수 있으며, 두개내 실동맥류¹⁶환자로부터 뇌척수액에서 입증된 바와 같이 임상적 중요성을 가질 수 있다.

현재, 펩티드 서열의 식별 외에도 질량 분석법을 통해 절대 및 상대적 수량의 데이터를 얻을 수 있다. 절대 수량에서, 생물학적 샘플의 펩티드 수준은 합성 표준과 비교되며, 상대적 수량에서 펩티드 수준은 2개 이상의 샘플 중에서 비교된다¹⁷. 상대적 수량은 다음 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다 : 1) “레이블 무료”¹⁸; 2) 생체 내 대사 라벨링 또는 3) 화학 라벨링. 마지막 두 펩티드^19,20에 통합된 안정적인 동위원소 형태의 사용을 기반으로 한다. 라벨프리 분석에서 펩타이드 수준은 ^LC-MS18 동안 신호 강도(스펙트럼 수)를 고려하여 추정된다. 그러나, 동위원소 라벨링은 펩티드의 보다 정확한 상대적 수준을 얻을 수 있다.

많은 펩티도믹 연구는 트리메틸람모늄 부티레이트(TMAB)를 화학 라벨링으로 라벨링하는 시약을 사용했으며, 최근에는 포름알데히드와 시아노보하이드라이드 나트륨 시약의 유정 및 비유화 된 형태를 가진 아민 (RMA)의 환원 메틸화를 사용했습니다111,21,22. 그러나, TMAB 라벨은 상업적으로 사용할 수 없으며, 합성 과정은 매우 힘들다. 한편, RMA에서 시약은 시판되고, 다른 라벨에 비해 저렴하며, 절차는 수행하기가 간단하며, 표지된 펩타이드는 안정^23,24이다.

RMA의 사용은 펩티드가 포름알데히드와 반응할 수 있도록 함으로써 쉬프 기지를 형성하는 것을 포함하고, 그 다음에 시아노보로하이드라이드를 통해 환원 반응에 선행됩니다. 이 반응은 N 단자 및 리신 사이드 체인및 단백석 N 단자 프롤라인에 무료 아미노 그룹의 디메틸화를 일으킵니다. 프롤린 잔류물이 N 단자에서 자주 드물며, N-terminus에 무료 아민이 있는 거의 모든 펩타이드는 두 개의 메틸 군^23,24,25로 표시된다^.