JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Live-Cell Imaging av transkriptionell aktivitet vid DNA Double-Strand Breaks

Published: September 20, 2021
doi:
10.3791/62968
, , ,
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes,Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Summary

Detta protokoll presenterar ett nytt reporter gensystem och den experimentella inställningen för att upptäcka transkription vid DNA dubbelsträng bryter med enmolekylskänslighet.

Abstract

DNA-dubbelsträngsbrytningar (DSB) är den allvarligaste typen av DNA-skador. Trots de katastrofala konsekvenserna för genomets integritet är det än så länge svårfångat hur DSB påverkar transkription. En anledning till detta var bristen på lämpliga verktyg för att samtidigt övervaka transkription och induktion av engenic DSB med tillräcklig tidsmässig och rumslig upplösning. Detta arbete beskriver en uppsättning nya reportrar som direkt visualiserar transkription i levande celler omedelbart efter induktion av en DSB i DNA-mallen. Bakteriofag RNA stamslingor används för att övervaka transkriptionen med enmolekylskänslighet. För att rikta DSB till en specifik genregion är reportergenerna konstruerade för att innehålla en enda igenkänningssekvens av den homing endonuclease I-SceI, annars frånvarande från det mänskliga genomet. En enda kopia av varje reporter gen integrerades i genomet av mänskliga cellinjer. Detta experimentella system gör det möjligt att upptäcka enskilda RNA-molekyler som genereras av den kanoniska genutskriften eller genom DNA-breakinducerad transkriptionsinitiering. Dessa reportrar ger en oöverträffad möjlighet att tolka de ömsesidiga interaktionerna mellan transkription och DNA-skador och att avslöja hittills ouppskattade aspekter av DNA-breakinducerad transkription.

Introduction

DNA-dubbelsträngsbrytningar (DSB) är giftiga DNA-lesioner som stör cellfunktionen och bidrar till upproret av flera sjukdomar och åldrande1. Mutationer som härrör från felaktig reparation av DSBs påverkar genuttryck och sätta grunden för den funktionella nedgången av cellen. Den framväxande uppfattningen att DSBs driver de novo break-inducerad transkription på lesion webbplats2,3,4,5,6,7 tyder på att DSBs kan också påverka cellulära funktionen genom break-inducerad RNAs. Flera nyligen genomförda studier visar att DSB är tillräckliga för att initiera programmerad (t.ex. vid stimulansinducerbara gener) och oplanerad (t.ex. vid icke-kanoniska promotors) transkription4,5,7. Men trots flera studier som undersöker sambanden mellan DNA-skador och transkription, släpade fältet fortfarande efter i sin förmåga att leverera en exakt (dvs. enmolekyl) karakterisering av transkriptionshändelserna vid DNA-brytplatser. En viktig orsak till detta var bristen på lämpliga experimentella verktyg. Cellbestrålning (γ strålar, röntgenstrålning, tunga joner) och läkemedelsbehandlingar (t.ex. topoisomerashämmare eller interkalerande medel) saknar rumslig precision och inducerar andra DNA-lesioner än DSB, inklusive ensträngade brott och DNA-adduater8. Endonukleaser, såsom I-PpoI och AsiSI, genererar locus-specifika DSB men har inte kombinerats med ett system som möjliggör samtidig live-cell visualisering av transkription vid en enda locus med hög temporal precision8. För att kringgå denna begränsning ledde vårt labb att utveckla en uppsättning banbrytande reportrar som direkt visualiserar transkription med enmolekylsupplösning vid kontrollerad induktion av en unik DSB4. Här beskriver vi dessa reportrar, tillhandahåller ett detaljerat protokoll för live-cell imaging av transkription vid DSBs och visar data som avslöjar transkription initiering vid en enda DSB.

Reportergensystemen som används i detta protokoll är baserade på den väl karakteriserade musen IgM-reportergenen och innehåller exonerna M1 och M2 av den membranbundna formen (μm) av IgM-μ tung kedja9,10,11. En hybrid intron separerar de två exons med den starka adenovirus stora sena transkription (AdML) PY tract12. Uttrycket av reportergenerna styrs av den mänskliga cytomegaloviruspromotorn (CMV), i vilken två tandemkopior av Tet-operatorn (TetO) sekvensen har infogats. Reportergenerna sätts in i en plasmidvektor som innehåller en FLp Recombination Target (FRT) -plats och sätts in i en specifik FRT-målplats i arvsmassan hos en HEK293-värdcelllinje. Denna cellinje uttrycker också konstituerande Tet repressor protein för att reglera uttrycket av reporter genen via förekomsten eller frånvaron av tetracyklin/doxycyklin. För att tillåta visualisering av reporter gen transkription, 24 tandem repetitioner av MS2 stam loop sekvens och 24 tandem repetitioner av PP7 stam loop sekvens infogades på olika positioner med avseende på transkription start plats och exon /intron struktur av reporter genen. MS2/PP7 RNA stamslingor bildas vid transkription och är specifikt bundna av extopiskt uttryckta MS2/PP7-pälsproteiner märkta med gröna och röda fluorescerande proteiner, en strategi som ofta använts tidigare för att avbilda transkription13,14,15. Dessutom infogades en enda kopia av 18 bp igenkänning sekvensen för homing endonuclease I-SceI som är direkt flankerad av RNA stam-loop sekvens matriser i reporter generna. Standard kloning tekniker användes för att generera alla plasmider, fragment som innehåller I-SceI-24xMS2 stam-loop av PROP reporter genen syntetiserades av en kommersiell gen syntetisering tjänst.

Den proximala DSB-reportergenen (PROP) konstruerades genom att I-SceI-skärplatsen 45 baspar (bp) nedströms den förmodade transkriptionsstartplatsen i exon I, följt av 149 bp fram till början av 24x MS2 stamslinga, som var de novo utformad med två alternerande icke-identiska stamslingsekvenser16 och ytterligare fem icke-repetitiva 20 bp distanssekvenser för att minska redundansen. MS2 stam-loop matrisen följs av 72 bp fram till början av 1844 bp intron och 1085 bp exon II tills klyvning och polyadenylation plats. Exon II kodar ett cyan fluorescerande protein (CFP) smält till en C-terminal peroxisomal målsekvens (PTS) från den mänskliga peroxisomala acyl CoA oxidas för att möjliggöra en oberoende screening av reporter genuttryck (figur 1A).

Exon II DSB reporter genen (EX2) består av en 167 bp exon jag följt av intron och exon II kodning CFP-PTS. Längre nedströms på ett avstånd av 169 bp sattes en kassett som innehåller 24x MS2 stamslingor in, följt av en 84 bp-länksekvens med en I-SceI-plats i mitten, följt av 24x PP7 stamslingor och 221 bp tills klyvnings- och polyadenyleringsstället17 (figur 1B).

Slutligen är exon II DSB reporter genen med antisense transkription märkning (EX2AS) baserad på den mänskliga ubiquitin B (UBB) gen transkript UBB-201 och innehåller två exons och en intron. Exon jag har en total längd på 1534 bp med en omvänd insättning av 24x MS2 stam-loop sekvens. Därför kommer den korrekta MS2 stem-loop RNA sekvensen att transkriberas i en antisense riktning med avseende på sinne transkription av reporter genen från CMV promotorn. Intronen har en längd på 490 bp, följt av exon II med I-SceI-webbplatsen , och en kodningsregion sattes in för två in-frame ubiquitin underenheter. Nedströms UBB-genen är en sekvens som bildar en 24x PP7 stamslinga vid transkription av reportergenen i en meningsriktning (figur 1C).

Transient transfection av en inducible konstruktion av homing endonuclease I-SceI möjliggör kontrollerad skapande av en DSB på infogade igenkänning webbplats inom varje reporter gen18. I-SceI endonuclease smälts i ram med ligand-bindande domänen för glukokortikoiderreceptorn och ett långt rött fluorescerande protein iRFP713. Denna konstruktion är cytoplasmisk i avsaknad av triamcinolonactonid (TA) men migrerar snabbt in i kärnan vid tillsats av TA till cellernas tillväxtmedium (figur 1D). Induktion av DSB av I-SceI-systemet är robust, vilket visades före 18,19,20. Reporter gen transkription kan övervakas parallellt genom att visualisera fluorescerande taggade RNA stam-loop system MS2 och PP7.

Protocol

1. Beredning och transfektion av celler för levande cellmikroskopi Förbered en 25 cm2 cellodlingskolv av reporterns cellinje (EX2, EX2-AS eller PROM) med 5 ml DMEM för att uppnå 80-90% sammanflöde dagen före experimentet med levande cellmikroskopi. Aspirera mediet med en pipett från 25 cm2-cellsodlingskolven och tvätta cellerna med 2,5 ml 1x PBS. Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA (0,05%) och inkubera vid 37 °C i 2-3 min för cellavlossning. Efter cellavlossning, tillsätt 4 ml DMEM utan fenolrött innehållande HEPES-buffert, kompletterat med 10% (v/v) kol-avskalat fetalt bovinserum och återanvänd cellerna försiktigt. Platta 1 ml av celllösningen i en 35 mm rund skål med 10 mm glasbottenbrunn (diameter nr 1.5) och homogenisera. Förvara den 35 mm runda skålen i en 100 mm standardcellskulturskål och inkubera den vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5% CO2. ~6 h efter sådd, transfektera cellerna i glasbottenskålen. För varje transfektblandning, förbered två lösningar på följande sätt: I ett 1,5 ml mikrocentrifugerör bereder du lösning A som innehåller 150 μL reducerat serum minimalt essentiellt medium (MEM), plasmid-DNA (enligt beskrivningen i tabell 1) och 2,5 μg/μL DNA från reagens för transfekter (se Materialtabell). Förbered därmed lösning B, som innehåller 150 μL MEM med reducerat serum och 1,5 μg/μL DNA från ett lipidbaserat transfekteringsreagens (se Materialtabell). Inkubera båda lösningarna vid rumstemperatur (RT) i 5 min. Tillsätt sedan försiktigt lösning A till lösning B och inkubera 20 min vid RT. För att transfektera cellerna, tillsätt 300 μL lösning A + B droppviss till varje skål och fördela försiktigt. Förvara glasbottenskålen i en 100 mm standardcellskulturskål och inkubera den vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5% CO2. Förbered ett 1,5 mL mikrocentrifugerör med 200 μL DMEM med HEPES, utan fenolrött kompletterat med 10% (v/v) kol-avskalat fetalt bovinserum och tillsätt TA till en koncentration av 7,5 x 10-7 M. 2. Experimentell installation Ställ in temperaturen på den stora inkubationskammaren för plexiglasmikroskop och inkubationskammaren i det övre skedet till 37 °C vid den gemensamma styrenheten. Ställ in miljöförhållandena inuti scenen inkubationskammaren på 5% CO2 och 100% fuktighet.OBS: Mikroskopburen och inkubatorns temperatur måste ställas in minst 1 h innan försöket påbörjas så att hela systemet kan värmas upp för att minimera temperaturfluktuationerna. Starta alla andra mikroskopstyrnings- och driftenheter samtidigt. Inducera transkriptionen av reportergenerna genom att tillsätta doxycyklin (0,5 μg/ml) till tillväxtmediet och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner med en 200 μL mikropipette ~1 h innan mikroskopiobservationen påbörjas.OBS: Förvara glasbottenskålen med de transfekterade cellerna inuti en 100 mm standardcellkulturskål för enkel hantering och transport från cellkulturen till mikroskoprummet i en frigolitbehållare för att hålla temperaturen så stabil som möjligt. Transportera cellerna till mikroskopet minst 30 min innan observationen påbörjas och vid ankomsten placera 100 mm skålen med cellerna omedelbart inuti den föruppvärmda stora mikroskopinkubationskammaren. Placera mikrocentrifugeröret med den förspädda TA från steg 1.7. inuti det stora mikroskopet miljökammare för att värma upp till 37 °C. Byt ut locket på glasbottenskålen som liknar det som tidigare förberetts med ett hål med 3 mm diameter som borrats in i locket (figur 2A).OBS: TA kommer att läggas till senare i cellerna genom det lilla hålet i locket utan att manipulera skålen monterad på mikroskopstadiet. Välj 100x (apokromatic objective, 1.4 numerisk bländare) oljesänkningsmål i mikroskopkontrollpanelen. Applicera en droppe nedsänkningsolja på målet. Ställ glasbottenskålen med cellerna inuti mikroskopsteginkubationskammaren och lås den på plats. Stäng locket på sceninkubatorn och alla dörrar i mikroskophuset. Starta mikroskopets drift- och kontrollprogramvara, öppna fönstret Fokuskontroll (bild 2B), klicka på fönstret Scope och klicka på rutan 100 % ögon i rutan 100 % ögon för att ställa in okulärstrålebanan för direkt provobservation med öga. På Filteruppsättningsmenyn växlar du till Ögonfilteruppsättning och klickar på Brightfield och trycker på knappen Öppna Brightfield . Flytta mikroskopmålet mot glasbottenskålen tills oljan vidrör glaset. Titta sedan igenom okularerna och fokusera manuellt på cellernas plan. Stäng av knappen Öppna Brightfield . Lämna cellerna i 30 minuter innan du påbörjar de experimentella observationerna för att anpassa sig till miljöförhållandena och förhindra fokal drift vid avbildning genom temperaturgradienter. Placera en 200 μL mikropipette och 200 μL filterspetsar som är redo att användas åt sidan vid rumstemperatur. 3. Bildförvärv I fönstret Fokuskontroll i mikroskopstyrningsprogrammet ställer du in laserintensiteten på 5 % och anger värdet 50 ms för exponeringstiden (bild 2B). Öppna fönstret Fånga om du vill justera inställningarna för att utföra ett automatiserat bildförvärv av tredimensionella (3D) tidsförlopp (bild 2C). Välj 3D-insamlingsförvärvstypen och ställ in 12 till 16 optiska segment åtskilda med 0,4 μm, markera kryssrutorna för Intervall runt ström och Återgå till aktuell position efter fångst. Ange värdet 120 för tidspunkterna och 30 sekunder för intervallet i fönstret Timelapse Capture. Välj det konfokala filteruppsättningen enligt de transfekterade fluorescerande proteinetiketterna med λ = 488 nm för GFP, λ = 561 nm för TagRFPt och λ = 640 nm för iRFP713 och ställ in exponeringstiden för varje kanal till 50 ms. Använd inställningen Aktuell för lasereffekten om du vill använda värdet 5 % som valts i fokusfönstret (bild 2C). Gå till kamerafönstret i fönstret Fokuskontroll, välj kontrollen för visning av skalningsbilder och välj knappen Manuell för att ställa in ett fast intervall med bildintensiteter som ska visas. Ange värden för Låg: 500 och Hög: 5000 (se bild 2B).OBS: Den här inställningen begränsar kamerainspelningens dynamiska omfång som visas i livevyn för att markera celler inom samma intervall av fluorescensintensiteter (bild 2D). Välj cellerna för 3D-avbildning av transkriptionsplatser vid induktion av en DSB. Screena cellerna och markera tre synfält enligt de villkor som beskrivs i diskussionen. Fokusera varje markerad cell som tidigare fanns i mitten av synfältet med transkriptionsplatsen i Z-stackens mittplan.OBS: Centrering av cellen och transkriptionsplatsen i XYZ rymmer för viss rörelse av cellen. Markera varje XYZ-position i XY-fönstret i fönstret Fokuskontroll genom att klicka på Ange punkt.OBS: Besök de valda positionerna 2-3 gånger under de följande 5 minuterna för att bekräfta kontinuerlig transkription av reportergenerna och relativ positionsstabilitet för cellernas positioner i XYZ-dimensioner. Tillsätt 200 μL av den förspädda TA från steg 1,7. cellerna enligt figur 2F.OBS: Var ytterst försiktig så att du inte vidrör glasbottenskålen eller locket medan du lägger till TA för att förhindra förskjutning från de markerade XY-positionerna. Efter DSB-induktion, bekräfta att cellerna är centrerade inom synfältet och transkriptionsplatsen är i mitten Z-planet. Omfokuserings- och positionsuppdateringen bör inte ta mer än 1-2 min. Starta 3D-tidsseriens avbildning genom att klicka på Starta i fönstret Fånga . Spara bilddata i mikroskopkontrollprogramvarans dataformat på mikroskopstyrningsdatorns hårddisk. 4. Dataanalys Öppna bilddata i mikroskopkontrollprogramvaran och exportera som 16-bitars TIFF-formatfiler. Öppna de exporterade filerna med StaQtool21-programvaran . Välj 3D-läget Enkel punkt och läs in bildfilerna genom att trycka på Gå.OBS: Den valda tidsserien öppnas i Max Projection Timelapse Viewer och visar en maximal intensitetsprojektion av z-stacken för den första gången (bild 3A). Justera bildintensiteten med det vertikala MAX-skjutreglaget till vänster. Välj den tidspunkt som ska analyseras med det vågräta skjutreglaget Timepoint . Håll markören till positionen för den märkta transkriptionsplatsen för manuell markering eller använd funktionen Identifiera automatiskt och tryck på respektive transkriptionsplats om flera objekt upptäcktes. Använd funktionen Auto Track för att bestämma XYZ-positionerna för transkriptionsplatsen över tid.OBS: Om en viss position inte spårades korrekt väljer du transkriptionsplatsen manuellt enligt StaQtools programvaruhandbok. Tryck på autoknappen för att utföra Gauss-monteringen för varje tidpunkt och mäta den totala fluorescensintensiteten (TFI).OBS: Om transkriptionsaktiviteten upphör förblir spårningsverktyget på den sista positionen där ett diffraktionsbegränsat objekt (en märkt transkriptionswebbplats) upptäcktes. Om cellen rör sig i XY-riktning efter att avskriftsplatsens etikett har försvunnit krävs en manuell ompositionering av sökrutan . När du har avslutat TFI-värdepassningen för varje tidpunkt trycker du på knappen Avsluta tidlapse för att stänga den aktuella bildfilen för tidsserier och fortsätter till nästa fil.TFI-värdena exporteras och sparas automatiskt i en Excel-fil. 5. Mätningar och analyser av mikroskopikalibrering Fröceller till 35 mm glasbottenfat och transfektera med de fluorescerande märkta MS2- och PP7-pälsproteinerna enligt beskrivningen i avsnitt 1.OBS: För kalibreringsmätningarna, använd samma reportergencelllinjer som beskrivs i introduktionen. Tillsätt 0,5 μg/ml doxycyklin till tillväxtmediet i cellerna 1 h innan mikroskopibilden påbörjas. Montera glasbottenskålen inuti mikroskopsteginkubationskammaren och förbered bildförvärvet som tidigare (se avsnitt 2).OBS: Det ursprungliga locket på glasbottenskålen byts inte ut för kalibreringsexperimenten. Använd samma laserintensitets- och exponeringsinställningar som beskrivs i punkt 3.1. Ange inställningarna för 2D-tidsserier (avmarkera 3D-alternativet i fönstret Fånga typ ) och ange 120 tidpunkter med intervaller på 500 ms på timelapse capture-panelen (bild 2C).OBS: Den här inställningen för bildförvärv resulterar i tidsserier inom ett enda optiskt plan med mycket korta intervall. Skaffa dussintals kalibreringstidsserier från flera positioner för att generera datauppsättningar för att räkna flera hundra enskilda transkript TFI-mätningar. För analys av kalibreringstidsserien konverterar du filerna till 16-bitars TIFF-formatfiler i enlighet med punkt 4.1. Öppna de exporterade filerna med StaQtool21-programvaran (bild 3). Tryck på knappen Välj LOG-fil och välj Loggfil för respektive 2D-tidsserie som förvärvats enligt beskrivningen i punkt 4.2. Markera kryssrutan Flera fläckar 2D och tryck på GO-knappen för att läsa in tidsserien i analysprogramvaran. I fönstret Timelapse-visningsprogrammet (bild 3A) i PSF FWHM infogar indatafältet det värde som beräknas för mikroskopsystemet och målet enligt beskrivningen21. Om du vill starta analysprocessen trycker du på knappen Identifiera automatiskt för att identifiera alla diffraktionsbegränsade objekt för den aktuella tidsperioden som visas. Klicka sedan på AutoFit för att utföra Gaussian Fitting för att bestämma TFI-värdet för varje objekt (bild 3A). Du kan också peka markören över ett diffraktionsbegränsat objekt och klicka för att markera det (grön cirkel i en vit ruta visas) och tryck på Gaussian Fit-knappen för manuell markering och Gauss-monteringsprocedur.OBS: Det sista läget rekommenderas för att utesluta objekt som inte räknas, till exempel ljusa transkriptionsplatser med flera gryende transkriptioner som finns i samma kärna. Tryck på knappen Avsluta timelapse för att avsluta föregående steg.Resultaten sparas automatiskt i ett Microsoft Excel-filformat i samma mapp som bildfilen. Starta TFI- och W-fördelningsmodulen för flera ställen genom att trycka på respektive knapp (bild 3B). Ladda Excel-filer via knappen Lägg till fil och starta TFI-analysen genom att trycka på Gå-knappen.OBS: Utdata är det genomsnittliga TFI-värdet som bestäms av flera uppmätta TFI för enskilda transkriptioner. Starta W-analysen genom att infoga psf FWHM som tidigare användes i punkt 5.10. och tryck på knappen Gå med standardvärdet för lagerplatsen.OBS: W-parametern är kvalitetskontroll för de enda TFI-mätningarna av transkriptioner för att uppfylla rätt PSF FWHM-värde för det mikroskopsystem som används. 6. Sammanslagning av data och kalibrering Ange de TFI-värden för tidsserier som erhålls från Excel-bladet som sparats i punkt 4.8. till ett nytt Excel-blad och dividera varje tidspunktsvärde med medelvärdet TFI för enstaka transkriptioner som erhålls i punkt 5.15.För att standardisera den här processen användes anpassade Excel-mallformulär.

Representative Results

De cellinjer som hyser reportergenerna som beskrivs i figur 1A-C tillåter studier av transkriptionsdynamik vid en enda DSB i levande celler. Siffrorna i figur 1A-C under varje grafisk reportergenrepresentation anger längden i kilobaspar (kbp). CMV indikerar cytomegaloviruspromotorn, TetO är Tet-operatorsekvenserna, pA belyser 3′ klyvning och poly-adenylation plats vid genänden. CFP-PTS är det kodade cyan fluorescerande proteinet smält till en peroxisomal målsignal, och 2UBB är den kodade mänskliga ubiquitin B tandemenheten. Genom att följa protokollet och analysförfarandena som beskrivs ovan är det möjligt att få grafer som visar antalet fluorescerande märkta reportergenutskrifter över tid, med en tidsupplösning på sekunder över perioder på upp till timmar (figur 4A-D). Diagrammet i figur 4A visar tidsförloppet för TFI-värden för en PROM-reporter gen transkription plats märkt av ackumulering av MS2-GFP molekyler på gryende transkriptioner. Det här diagrammet representerar ett kontrollexperiment utan TA-tillägg. Därför induceras ingen DSB. Transkriptionen fortsätter med burst-liknande toppar och 2-8 transkriptioner åt gången under hela observationsperioden på 60 min. Liknande resultat erhölls för EX2- och EX2-AS-reportergenerna (data som inte visas här)4. Induktion av en enda DSB i reportergenerna (med hjälp av I-SceI-GR-iRFP) gör det möjligt att studera DSB: s inverkan på den pågående reportergenutskriften och övervakningen av transkriptionshändelser som kommer från DSB-webbplatsen, nämligen breakinducerad transkription (figur 4B-D). Dynamiken hos DNA-nedbrytningsinducerad transkription beror på DSB:s placering i genenInduktion av en enda DSB av I-SceI-GR-iRFP i reporter genen med en proximal I-SceI erkännande webbplats leder till transkriptionell ljuddämpning av reporter genen efter cirka 11 min efter TA tillägg, och transkriptionen återställs inte inom 60 min observationsperioden (figur 4B). Vid observation av EX2 reporter gen transkription, fullständig undertryckande av den kanoniska promotorn-driven transkription upptäcktes av en samtidigt fullständig förlust av både MS2-GFP och PP7-RFP signaler cirka 30 min efter TA tillägg. Inom 10 minuter startar dock transkription om, vilket framgår av återutformande toppar av PP7-RFP fluorescens. Fullständig återställning av PP7-RFP-signalen (och inte MS2-GFP-fluorescens) visar breakinducerad transkriptionsinitiering (figur 4C). Den brytinducerade transkriptionen är inte stabil under långa perioder; Det verkar burst-liknande och låg toppintensitet, vilket indikerar att endast ett fåtal brytinducerade transkript initierades från DSB-webbplatsen. EX2AS reporter genen, som innehåller en 24x PP7 stam-loop matris i exon II nedströms I-SceI webbplats för att upptäcka sinne transkription, visar den kanoniska promotorn-driven transkription avslutas inom EX2AS reporter gen inom cirka 25 min efter TA tillägg. Det ersätts sedan av antisense break-inducerad transkription, vilket framgår av ackumulering av MS2-GFP proteinbindning till RNA som genereras från antisense MS2 stam-loop sekvenser (figur 4D). Antisense transkriptionell aktivitet var frånvarande före avbrottet av sinne transkription på grund av induktion av DSB och visar i detta exempel att flera transkriptioner initierades från rastplatsen inom cirka 15 min. De representativa data som erhålls här visar att DSB har olika effekter på transkription beroende på deras plats inom genen, som nyligen rapporterades4. Data visar också en cell till cell variabilitet i tidpunkten för DSB induktion av I-SceI-GR-iRFP, som sträcker sig från 12 till 30 min efter TA tillägg. Dessutom gör det möjligt att upptäcka enskilda transkriptioner upptäcka skillnader mellan celler och brytplats mot intensiteten i den breakinducerade transkriptionsaktiviteten. Den break-inducerade transkriptionen detekteras endast vid DSBs inom genen. Det är frånvarande vid proximala DSB, där den kanoniska transkriptionen upphör på en DSB för den återstående observationsperioden. Bild 1: Reportergener och systemet för att inducera DNA-dubbelsträngsbrytningar. Den schematiska representationen i (A) till (C) visar strukturen hos de tre reportergener som används för att studera transkription vid induktion av en DNA-dubbelsträngsbrytning. Reporter genen med proxir-proximal I-SceI webbplats i den första exon (PROM) flankeras nedströms av en 24x MS2 stem-loop (MS2-SL) sekvens matrisen avbildas i (A). Reporter genen med I-SceI plats i den andra exon (EX2) flankeras uppströms med en 24x MS2 stam-loop sekvens och nedströms av en 24x PP7 stam-loop (PP7-SL) matris visas i (B). Reporter genen med I-SceI plats ligger i exon II med en anti-parallell insättning av 24x MS2 stam-loop sekvens uppströms I-SceI webbplats för att upptäcka antisense transkription (EX2-AS) visas i (C). Funktionen hos fusionsproteinkonstruktionen I-SceI-GR-iRFP avbildas i (D) med en grafisk display och motsvarande bilder av levande celler nedan. Vid övergående uttryck av konstruktionen (röd färg) i reporter gen cellinjer, proteinet är uteslutande cytoplasmic, vilket förhindrar en för tidig klyvning av målplatsen av I-SceI endonuclease. Vid tillsats av TA börjar fusionsproteinet migrera in i cellkärnan (indikeras av en streckad linje) och börjar ackumuleras mellan 5-15 min. Scalebar = 10 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra. Bild 2: Välja celler för 3D-avbildning av transkriptionsplatser. Bilden i (A) visar en 35 mm glasbottenskål som används för levande cellavbildning, med ett anpassat modifierat lock, där ett hål med 3 mm diameter borrades för att lägga till TA utspädd i tillväxtmedium direkt. Hålets placering är markerad med en röd cirkel. Panelen i (B) visar en skärmdump av “Focus”-fönstret i mikroskopkontrollprogramvaran för att ställa in exponeringstiden för livevisning, filterinställning, laserintensitet och skalbildsdisplay för att screena efter celler för efterföljande tidsfördröjning i (C), skärmdumpen av motsvarande “Capture” -fönster för att justera alla inställningar för levande cellers 3D-tidsfördröjningsförvärv. De specifika inställningarna för rutorna Filter, Capture Type, Time-Lapse Capture och 3D Capture beskrivs i avsnitt 3. I vyn som visas här justeras inställningarna för att förvärva en 3D-tidsfördröjning av PROM-reporter genlinjen transfected med MS2-GFP och I-SceI-GR-iRFP konstruktioner för avbildning transkription vid induktion av en DNA dubbelsträng brytning i promotorn-proximal regionen av reporter genen. Bilden i (D) slås samman för GFP- och iRFP-kanalerna och visar ett synfält sett genom mikroskopsystemet, med flera celler i gencellslinjen 293-PROM reporter. Cellerna var co-transfected med tandem dimer MS2 coat protein konstruktion smält till en nukleär lokalisering sekvens, två gröna fluorescerande proteiner (GFP-MS2CP) och I-SceI-GR-iRFP konstruktion. Flera celler visar uttryck för GFP-MS2CP konstruktion, vilket belyser atomkärnorna och I-SceI-GR-iRFP konstruktion som belyser cytoplasma. Den streckade fyrkanten anger det förstorade område som visas i (E). För 3D-avbildningen väljs celler enligt de krav som anges i diskussionen, till exempel cellen med den större kärnan i det förstorade området i (D). Denna cell är transfected med både fluorescerande konstruktioner och visar en ljust märkt transkription plats (arrowhead) genom att ackumulera GFP-MS2CP på de novo transkriberad reporter gen pre-mRNAs (vänster bild). Cellernas tillväxtmedium innehåller inte TA; Därför är I-SceI-GR-iRFP-konstruktionen uteslutande cytoplasmisk (höger bild). I (F) monteras glasbottenskålen i mikroskopets inkubationskammare för 3D-tidsfördröjningsexperiment och är utrustad med det anpassade locket som innehåller TA-lasthålet. 200 μL mikropipettespetsen sätts försiktigt in i hålet för att applicera den utspädda TA på cellernas tillväxtmedium. Scalebar = 10 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Programvara för bildförvärv och analys. Panelen i (A) visar en skärmdump av STaQTool: Spot tracking and quantification tool. Bilden visar en exempeltidsserie av PROM-reporterns gencelllinje med märkt transkriptionsplats markerad med en grön cirkel/vit kvadrat i den maximala intensitetsprojektionsdisplayen i mitten. Fönstren på höger sida visar en förstorad vy över den valda transkriptionsplatsens plats, motsvarande 3D-skuggade intensitetsyta med 2D Gaussian-passformsnätet för den aktuella tidspunkten samt tomter för transkriptionsplatsens plats Z-position inom z-stacken, Gaussian-passformsbredden (W) och TFI-mätningen över tiden. Den mikroskopiska bilden i (B) visar ett zoomat enda optiskt plan av en kärna av en PROM-reporter gen cellinje transfected med MS2-GFP. Bilden representerar en engångspunkt i en 2D-kalibreringstidsserie med 120 tidpunkter. Kärnan visar flera fluorescerande märkta transkriptioner som förekommer som diffraktionsbegränsade objekt i nukleoplasmen (markerad med vita rutor). Den högra sidopanelen visar en skärmdump av TFI- och W-distributionsverktyget i STaQTool för att analysera flera platser i 2D-tidsfördröjningsförvärv. I den här exempelanalysen upptäckte verktyget 408 diffraktionsbegränsade fläckar som representerar reportergenutskrifter märkta med MS2-GFP som diffuseras i nukleoplasmen. Diagrammen till höger visar TFI och Gaussian fit width fördelning histogram av objekten och Gaussian passform kurvor. Medelvärdena TFI och W som härleds från positionen för den gaussiska passformskurvans mitttopp och de beräknade konfidensintervallen visas i respektive fönsterruta. Scalebar = 10 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: Representativa resultat av transkriptionsdetektering på platser för DUBBELsträngade DNA-brott. Diagrammen i (A) till (D) representerar den kalibrerade TFI-kurvan för en transkriptionsplats över tid. TFI-värdena omvandlas till transkriptioner med hjälp av medelvärdet TFI för enskilda transkript som mäts i kalibreringsexperimenten för respektive reportergenkonstruktion och fluorescerande taggat RNA-stamslingbindningsprotein MS2 eller PP7 som används i respektive experiment. I (A) visas ett diagram från ett kontrollexperiment med prom reporter genen utan TA tillägg. Transkriptioner märkta med MS2-GFP anger kontinuerlig transkriptionsaktivitet under hela observationsperioden. Diagrammet i (B) representerar PROM reporter genen på TA tillägg och induktion av en DSB som leder till en undertryckande av transkription för den återstående observationstiden. EX2 reporter gengrafen i (C) visar en transkription undertryckande av kanoniska promotor-driven transkription på TA tillägg. Senare i samma tidsfördröjning framträder endast PP7-RFP-märkt transkriptionsaktivitet. I diagrammet i (D) undertrycks EX2-AS-reportergenen transkription från den kanoniska promotorn i mening riktning på samma sätt på TA tillägg till EX2 reporter genen i (C). Utseendet på MS2-RFP märkta transkript som härrör från den inverterade MS2 stam-loop sekvensen indikerar dock antisense transkription frånvarande under känsla transkription verksamhet före TA tillägg. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Reporter cellinje EX2 och EX2-AS PROM Plasmider att transfektera 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP 0.65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry 0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP 0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP Tabell 1: Transfektion av reportergenens cellinjer. Tabellen beskriver transfektion scheman och mängder av de olika plasmider som används för att transfect de olika reporter gen cellinjer transiently.

Discussion

Konflikter mellan viktiga biologiska processer som replikering, transkription, DNA-skador och DNA-reparation har identifierats som en kritisk källa till genominstabilitet22. Dessa studier har också lett till upptäckten av transkription på platser för DNA-skador och tillskrivit en funktionell roll till de brytinducerade transkriptionerna för att reglera DNA-skador reparationsprocesser23. De nya verktygen och protokollet som beskrivs här möjliggör ytterligare undersökning av RNA Pol II transkriptionsdynamik vid DSB. En kritisk punkt i detta protokoll är genereringen av cellinjer som innehåller en enda kopia av reportergenen integrerad i genomet. Denna nyckelfunktion eliminerar bruset som skapas av transkriptionen av flera reportergener integrerade med flera kopior inom en enda genomisk locus och möjliggör insamling av kinetiska parametrar för transkriptionsdynamik och enskilda RNA-transkriptioner. Ett avgörande tekniskt krav för att observera transkription av enstaka reporter genintegrationer är tillgången till ett mikroskopsystem som gör det möjligt att upptäcka enskilda RNA-transkriptioner märkta med MS2- eller PP7-systemet i levande celler4,12. Här utförs live-cellmikroskopi på ett confocal spinning disksystem monterat på ett inverterat mikroskop, utrustat med 100 mW solid state-lasrar kopplade till ett akustiskt optiskt tunable filter som beskrivs någon annanstans24. För att studera transkription vid en enda DSB med hjälp av reportrarna måste dessutom enskilda celler övervakas noggrant för att uppnå den högsta tidsupplösningen, vilket kräver bild avbildningsceller i flera timmar, vilket gör detta till en låg genomströmningsanalys. Ändå observerar vi flera celler parallellt med positionering som styrs av ett piezodrivet mikroskopsteg. För att säkerställa optimala miljöförhållanden för observationer av levande celler under timmar placeras mikroskopkroppen, inklusive provstadiet, inuti en plexiglasmiljökammare. Dessutom monteras en sluten inkubationskammare på mikroskopstadiet och ansluts till CO2– och fuktighetsförsörjningsregulatorer.

Det första kritiska steget i protokollet är valet av områden av intresse med celler för avbildning. Varje XY-position som är markerad för avbildning skall innehålla en eller flera celler som visar transfektion med de fluorescerande RNA-stamslingbindningsproteinerna enligt reportergenen och transfekteringsschemat som beskrivs i avsnitt 1, tabell 1, samt i figur 2D, E. Dessutom måste cellerna uppvisa ljusmärkta transkriptionsplatser vara samtransfekterade med konstruktionen I-SceI-GR-GR-iRFP713, och proteinet måste lokaliseras inledningsvis i cytoplasma (figur 2D och E).

Cellerna ska visa en fluorescensintensitetsnivå av obundet fluorescerande märkt MS2- och/eller PP7-pälsprotein som är tillräckligt lågt för att detektera enstaka märkta transkript över bakgrundsfluorescensnivån. Samtidigt är en robust fluorescensintensitetsnivå av de fluorescerande märkta MS2- och/eller PP7-pälsproteinerna nödvändig för att tillåta avbildning över minst 60 minuter utan att förlora för mycket fluorescens på grund av viss blekning som uppstår. “Skala bildvisning” med ett fast intervall enligt beskrivningen i avsnitt 3.7 används för att möjliggöra ett standardiserat urval av celler enligt deras fluorescensintensitetsnivå.

Ett andra kritiskt protokollsteg är att lägga till TA till cellerna på förutbestämda XY-positioner genom det lilla hålet i locket på glasbottenskålen. All manipulering av glasbottenskålen skulle orsaka en förskjutning från cellernas markerade XY-position och måste undvikas. Därför är det viktigt att noggrant hantera mikropipetten samtidigt som ta-produkten späds ut i cellulära tillväxtmediet för att förvalda celler ska lyckas observera, vilket visas i figur 2F. Anpassningen av olika system för att lägga till läkemedel till celler monterade på ett mikroskopstadium, såsom ett perfusionssystem, skulle kräva en separat inkuberingskammare med röringång och utgångsöppningar och ett pump- eller injektionssystem för att administrera läkemedel. Andra metoder som kanalbilder med täckslipsliknande bottenytor resulterar i en långsam diffusion av administrerade läkemedel i kanalen och orsakar en ytterligare fördröjning mellan läkemedelstillsats och effekt. Slutligen kan inkautious pipettering i en kanalbildsöppning också flytta provpositionen. Därför är det nuvarande systemet med ett anpassat borrat hål i locket på en glasbottenskål enkelt att anpassa, billigt och lämpligt för att administrera olika tillväxtmedier, droger och komponenter. Hålets lilla diameter och den fuktade atmosfären i scenen inkubationskammaren förhindrar också uttorkning av cellmediet.

Ett tredje kritiskt steg i detta protokoll är dataanalysen, som kräver en manuell inspektion av tidpunkterna när transkriptionen upphör på grund av induktion av en DSB. Tidpunkten för att avsluta transkription anges genom att släppa de sista utskrifterna från den tidigare ljusmärkta platsen för reporter gen transkription. På samma sätt måste händelserna i break-inducerad transkription initiering inspekteras med försiktighet för att upptäcka enskilda transkription händelser med relativt lågt signal-till-brus förhållandet mellan enstaka fluorescerande märkta mRNAs.

Dynamiken i reparationen av den inducerade DSB lägger till ett extra lager av komplexitet till analyserna av data som genereras med hjälp av dessa reportrar, vilket begränsar dem till de första minuterna omedelbart efter induktion av DSB. Reportergenernas transgena natur och den repet rika karaktären hos MS2- och PP7-stamslingan kan sätta ihop ett unikt kromatinlandskap, vilket stör upprättandet av förmodade stabila breakinducerade transkriptionsprogram. Men jämfört med joniserande eller UV-bestrålning är I-SceI-medierad induktion av en DSB i reportergener ett mycket mer robust system för att undersöka transkription vid enskilda DSB.

Olika endonukleassystem som I-CreI, I-PpoI eller AsiSI som har eller inte har ytterligare igenkänningsplatser inom det mänskliga genomet kan kombineras med nuvarande reportergensystem för en möjlig högre effektivitet att generera DSB. De kräver dock att man först introducerar endonuclease-igenkänningsplatsen i reportergenerna. För det andra kan de ha en liknande variation på tidpunkten och effektivitetsinduktionen av en DSB i enskilda celler. Å andra sidan kan infogning av tandemkopior av endonuclease igenkänningsplatser öka effektiviteten av DSB induktion. Dessutom skulle testning av de presenterade reportergensystemen i olika cellinjer möjliggöra jämförelse av transkriptionsdynamik på DSB-platser mellan olika cellulära bakgrunder och tillgången till olika DNA-skador reparationsvägar som i cancerceller, primärceller och differentierade icke-cyklande celler. Konstruktionen av reportergenerna för att vara kompatibel med Flp/FRT-systemet begränsar dock för närvarande integrationen i tillgängliga Flp/ FRT-värdcelllinjer.

Förutom mikroskopibaserade tillämpningar kan de nuvarande reportergenerna också kombineras med biokemiska analyser, såsom kromatinimmunprecipitation, för att studera rekryteringen av DNA-reparations- eller transkriptionsfaktorer till en enda DSB eller för att bedöma nukleosombeläggning, histonmodifieringar och kromatintillstånd runt DSB-webbplatsen. Dessutom skulle en kombination med olika reportersystem möjliggöra studier av funktionella kopplingar mellan DNA-skador och processer som genomorganisation eller DNA-replikering.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca för gåvor av plasmider och reagenser. Vi står också i tacksamhetsskuld till iMM Bioimaging Facilitys personal, A. Temudo, A. Nascimento och J. Rino, för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete finansierades av PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 och PTDC/MED-OUT/4301/2020 från Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal och lisboa-01-0145-FEDER-007391, projekt som medfinansieras av FEDER genom POR Lisboa, Portugal 2020- Finansiering erhölls också från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (RiboMed 857119). M.A. är mottagare av FCT Ph.D. fellowship 2020.05899.BD.

Materials

100 mW solid-state Lasers Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system Intelligent Imaging Innovations Inc.
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 Photometrics, Tucson, AZ USA
Axio Observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss MicroImaging, Germany
Blasticidin InvivoGen ant-bl-1
charcoal-stripped fetal bovine serum Sigma-Aldrich F6765-500 ML
CO2 module S PeCon GmbH, Erbach, Germany
CSU-X1 confocal spinning disk unit Yokogawa Electric, Tokyo, Japan
DMEM Gibco 41966029
DMEM with Hepes no PhenolRed Gibco 21063-029
Doxicyclin Sigma-Aldrich D9891 for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium
FBS Gibco 10270106
Flp-In T-REx 293 cell line Thermo Fischer Scientific Invitrogen R75007
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence GeneArt, Thermo Fischer Scientific custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences
Heating Device Humidity 2000 PeCon GmbH, Erbach, Germany
Hygromycin B Roche 10843555001
Immersion oil Immersol 518 F Carl Zeiss MicroImaging Inc.) 444960-0000-000
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 Thermo Fisher Scientific L3000001 transfection helper reagent
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 lipid-based transfection reagent
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 MatTek Corporation, Ashland, MA, USA P35G-1.5-10-C
microscope incubation chamber PeCon GmbH, Erbach, Germany
pcDNA5/FRT/TO Thermo Fischer Scientific Invitrogen V652020
pOG44 plasmid Thermo Fischer Scientific Invitrogen V600520
SlideBook 6.0 Software Intelligent Imaging Innovations Inc.
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 PeCon GmbH, Erbach, Germany
StaQtool Software iMM-JLA Lisbon, Portugal available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip
triamcinolone acetonide (TA) Sigma-Aldrich T6501 synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus
Trypsin/EDTA Solution (TE) Thermo Fisher Scientific R001100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d’Adda di Fagagna, F. Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin. FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).
  3. Michelini, F., et al. Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks. Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).
  4. Vítor, A. C., et al. Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin. Science Advances. 5 (1), (2019).
  5. Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. Small RNA response at DNA ends in Drosophila. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).
  6. Wei, W., et al. A role for small RNAs in DNA double-strand break repair. Cell. 149 (1), 101-112 (2012).
  7. Francia, S., et al. Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response. Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).
  8. Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24 (2020).
  9. Alt, F. W., et al. Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3′ ends. Cell. 20 (2), 293-301 (1980).
  10. Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. The role of exon sequences in splice site selection. Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).
  11. Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65). Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).
  12. Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity. Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).
  13. Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
  14. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  15. Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).
  16. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  17. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  18. Soutoglou, E., et al. Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).
  19. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096 (1994).
  20. Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. Science. 341 (6146), 660 (2013).
  21. Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells. Methods. 98, 143-149 (2016).
  22. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  23. D’Alessandro, G., d’Adda di Fagagna, F. Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords. Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).
  24. Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).

Tags

Live-cell ImagingTranscriptional ActivityDNA Double-strand BreaksTranscription DetectionSingle-cell AnalysisDNA Damage ResponseTranscription-replication CrosstalkDoxycycline InductionCalibration MeasurementsMicrocentrifuge Tube PreparationTransfectionGlass Bottom DishMicroscopy Observation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
de Almeida, M. R., Gameiro, E., de Almeida, S. F., Martin, R. M. Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks. J. Vis. Exp. (175), e62968, doi:10.3791/62968 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image