डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक पर ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि की लाइव-सेल इमेजिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल एक नई रिपोर्टर जीन प्रणाली और एकल-अणु संवेदनशीलता के साथ डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक पर प्रतिलेखन का पता लगाने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप प्रस्तुत करता है।
Abstract
डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) डीएनए क्षति का सबसे गंभीर प्रकार है। जीनोम अखंडता पर विनाशकारी परिणामों के बावजूद, यह अब तक मायावी बना हुआ है कि डीएसबी प्रतिलेखन को कैसे प्रभावित करते हैं। इसका एक कारण प्रतिलेखन की निगरानी करने के लिए उपयुक्त उपकरणों की कमी और पर्याप्त अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ एक जेनिक डीएसबी का प्रेरण था। यह काम नए पत्रकारों के एक सेट का वर्णन करता है जो डीएनए टेम्पलेट में डीएसबी के प्रेरण के तुरंत बाद लाइव कोशिकाओं में प्रतिलेखन की कल्पना करते हैं। बैक्टीरियोफेज आरएनए स्टेम-लूप को एकल-अणु संवेदनशीलता के साथ प्रतिलेखन की निगरानी करने के लिए नियोजित किया जाता है। एक विशिष्ट जीन क्षेत्र के लिए डीएसबी को लक्षित करने के लिए, रिपोर्टर जीन को होमिंग एंडोन्यूक्लिएज I-SceI के एकल मान्यता अनुक्रम को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जाता है, अन्यथा मानव जीनोम से अनुपस्थित होता है। प्रत्येक रिपोर्टर जीन की एक एकल प्रति मानव सेल लाइनों के जीनोम में एकीकृत की गई थी। यह प्रयोगात्मक प्रणाली विहित जीन प्रतिलेखन द्वारा या डीएनए ब्रेक-प्रेरित प्रतिलेखन दीक्षा द्वारा उत्पन्न एकल आरएनए अणुओं का पता लगाने की अनुमति देती है। ये रिपोर्टर प्रतिलेखन और डीएनए क्षति के बीच पारस्परिक बातचीत की व्याख्या करने और डीएनए ब्रेक-प्रेरित प्रतिलेखन के अब तक के अप्रशंसित पहलुओं का खुलासा करने के लिए एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान करते हैं।
Introduction
डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) विषाक्त डीएनए घाव हैं जो सेल फ़ंक्शन को बाधित करते हैं और कई बीमारियों और उम्र बढ़ने के विद्रोह में योगदान करते हैं। DSBs की गलत मरम्मत के परिणामस्वरूप उत्परिवर्तन जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं और सेल की कार्यात्मक गिरावट के लिए आधार निर्धारित करते हैं। आकस्मिक दृष्टिकोण है कि डीएसबी घाव साइट 2,3,4,5,6,7 पर डी नोवो ब्रेक-प्रेरित प्रतिलेखन को ड्राइव करते हैं, यह बताता है कि डीएसबी ब्रेक-प्रेरित आरएनए के माध्यम से सेलुलर फ़ंक्शन को भी प्रभावित कर सकते हैं। हाल के कई अध्ययनों से संकेत मिलता है कि डीएसबी प्रोग्राम किए गए (उदाहरण के लिए, उत्तेजना-अपरिवर्तनीय जीन पर) और अनिर्धारित (जैसे, गैर-विहित प्रवर्तकों पर) ट्रांसक्रिप्शन 4,5,7 शुरू करने के लिए पर्याप्त हैं। हालांकि, डीएनए क्षति और प्रतिलेखन के बीच संबंधों की खोज करने वाले कई अध्ययनों के बावजूद, यह क्षेत्र अभी भी डीएनए ब्रेक साइटों पर ट्रांसक्रिप्शनल घटनाओं के सटीक (यानी, एकल-अणु) लक्षण वर्णन को वितरित करने की अपनी क्षमता में पिछड़ गया। इसका एक महत्वपूर्ण कारण उपयुक्त प्रयोगात्मक उपकरणों की कमी थी। सेल विकिरण (γ-किरणें, एक्स-रे, भारी आयन) और दवा उपचार (जैसे, टोपोआइसोमेरेस इनहिबिटर या इंटरकैलेटिंग एजेंट) में स्थानिक सटीकता की कमी होती है और डीएसबी के अलावा अन्य डीएनए घावों को प्रेरित किया जाता है, जिसमें एकल-स्ट्रैंड ब्रेक और डीएनए adducts8 शामिल हैं। एंडोन्यूक्लिएज, जैसे कि I-PpoI और AsiSI, लोकस-विशिष्ट DSBs उत्पन्न करते हैं, लेकिन एक ऐसी प्रणाली के साथ संयुक्त नहीं किए गए हैं जो उच्च अस्थायी परिशुद्धता के साथ एक ही स्थान पर प्रतिलेखन के एक साथ लाइव-सेल विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इस सीमा को बायपास करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने अत्याधुनिक पत्रकारों का एक सेट विकसित करने का नेतृत्व किया जो सीधे एक अद्वितीय डीएसबी 4 के नियंत्रित प्रेरण पर एकल-अणु संकल्प के साथ प्रतिलेखन की कल्पना करते हैं। यहां, हम इन पत्रकारों का वर्णन करते हैं, डीएसबी में प्रतिलेखन के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और एकल डीएसबी में प्रतिलेखन दीक्षा का खुलासा करने वाले डेटा दिखाते हैं।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले रिपोर्टर जीन सिस्टम अच्छी तरह से विशेषता वाले माउस IgM रिपोर्टर जीन पर आधारित हैं और इसमें IgM के झिल्ली-बाउंड फॉर्म (μm) के एक्सोन M1 और M2 होते हैं μ भारी श्रृंखला 9,10,11। एक हाइब्रिड इंट्रॉन मजबूत एडेनोवायरस प्रमुख देर से प्रतिलेख (AdML) PY tract12 के साथ दो exons अलग करता है। रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति को मानव साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर (सीएमवी) द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें टेट ऑपरेटर (टेटो) अनुक्रम की दो अग्रानुक्रम प्रतियां डाली गई हैं। रिपोर्टर जीन प्रत्येक एक प्लास्मिड वेक्टर में डाला जाता है जिसमें एक एफएलपी पुनर्संयोजन लक्ष्य (एफआरटी) साइट होती है और एक एचईके 293 होस्ट सेल लाइन के जीनोम में एक विशिष्ट एफआरटी लक्ष्य साइट में डाला जाता है। यह सेल लाइन टेट्रासाइक्लिन / डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति या अनुपस्थिति के माध्यम से रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए टेट दमनकारी प्रोटीन को भी व्यक्त करती है। रिपोर्टर जीन प्रतिलेखन के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए, एमएस 2 स्टेम लूप अनुक्रम के 24 अग्रानुक्रम दोहराव और पीपी 7 स्टेम लूप अनुक्रम के 24 अग्रानुक्रम दोहराव को ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट और रिपोर्टर जीन के एक्सोन / इंट्रॉन संरचना के संबंध में विभिन्न पदों पर डाला गया था। MS2 / PP7 आरएनए स्टेम लूप प्रतिलेखन पर बनते हैं और विशेष रूप से हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए एक्टोपिकल रूप से व्यक्त एमएस 2 / पीपी 7 कोट प्रोटीन द्वारा बाध्य होते हैं, एक रणनीति जो व्यापक रूप से ट्रांसक्रिप्शन 13,14,15 की छवि बनाने से पहले उपयोग की जाती है। इसके अलावा, होमिंग एंडोन्यूक्लिएज I-SceI के लिए 18 बीपी मान्यता अनुक्रम की एक एकल प्रतिलिपि डाली गई थी जो सीधे रिपोर्टर जीन में आरएनए स्टेम-लूप अनुक्रम सरणियों द्वारा flanked है। मानक क्लोनिंग तकनीकों का उपयोग सभी प्लास्मिड उत्पन्न करने के लिए किया गया था, प्रोप रिपोर्टर जीन के I-SceI-24xMS2 स्टेम-लूप वाले टुकड़े को एक वाणिज्यिक जीन संश्लेषण सेवा द्वारा संश्लेषित किया गया था।
प्रमोटर-समीपस्थ डीएसबी रिपोर्टर जीन (प्रोप) का निर्माण एक्सन I में परिष्कृत प्रतिलेखन प्रारंभ साइट के I-SceI काटने वाली साइट 45 बेस जोड़े (bp) डाउनस्ट्रीम को सम्मिलित करके किया गया था, इसके बाद 24x MS2 स्टेम-लूप कैसेट की शुरुआत तक 149 bp, जिसे दो वैकल्पिक गैर-समान स्टेम-लूप अनुक्रम16 के साथ डिज़ाइन किया गया था और अतिरेक को कम करने के लिए अतिरिक्त पांच गैर-दोहराए जाने वाले 20 बीपी स्पेसर अनुक्रम। MS2 स्टेम-लूप सरणी 1844 बीपी इंट्रोन की शुरुआत तक 72 बीपी और 1085 बीपी एक्सोन II के बाद होती है जब तक कि दरार और पॉलीएडेनिलेशन साइट तक नहीं। एक्सन II एक सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) को एन्कोड करता है जो रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति (चित्रा 1 ए) की एक स्वतंत्र स्क्रीनिंग की अनुमति देने के लिए मानव पेरोक्सिसोमल एसाइल सीओए ऑक्सीडेज से सी-टर्मिनल पेरोक्सिसोमल लक्ष्यीकरण अनुक्रम (पीटीएस) से जुड़ा हुआ है।
एक्सोन II DSB रिपोर्टर जीन (EX2) में 167 bp exon I होता है, जिसके बाद Intron और exon II CFP-PTS एन्कोडिंग करते हैं। आगे 169 बीपी की दूरी पर डाउनस्ट्रीम में, 24x MS2 स्टेम-लूप युक्त एक कैसेट डाला गया था, इसके बाद केंद्र में एक I-SceI साइट के साथ एक 84 बीपी लिंकर अनुक्रम, इसके बाद 24x PP7 स्टेम-लूप और 221 बीपी तक क्लीवेज और पॉलीएडेनिलेशन साइट 17 (चित्रा 1 बी) तक बीपी।
अंत में, एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्शन लेबलिंग (EX2AS) के साथ एक्सोन II DSB रिपोर्टर जीन मानव ubiquitin B (UBB) जीन ट्रांसक्रिप्ट UBB-201 पर आधारित है और इसमें दो एक्सोन और एक इंट्रोन शामिल हैं। एक्सॉन मेरे पास 24x एमएस 2 स्टेम-लूप अनुक्रम के व्युत्क्रम सम्मिलन के साथ 1534 बीपी की कुल लंबाई है। इसलिए, सही MS2 स्टेम-लूप आरएनए अनुक्रम को सीएमवी प्रमोटर से रिपोर्टर जीन की भावना प्रतिलेखन के संबंध में एक एंटीसेंस दिशा में ट्रांसक्रिप्ट किया जाएगा। इंट्रॉन की लंबाई 490 बीपी है, इसके बाद I-SceI साइट के साथ एक्सोन II है, और दो इन-फ्रेम यूबिकिटिन सबयूनिट्स के लिए एक कोडिंग क्षेत्र डाला गया था। UBB जीन का डाउनस्ट्रीम एक अनुक्रम है जो एक अर्थ दिशा में रिपोर्टर जीन के प्रतिलेखन पर एक 24x PP7 स्टेम-लूप बनाता है (चित्रा 1 C)।
होमिंग एंडोन्यूक्लिएज I-SceI के एक inducible निर्माण के क्षणिक अभिकर्मक प्रत्येक रिपोर्टर gene18 के भीतर सम्मिलित मान्यता साइट पर एक DSB के नियंत्रित निर्माण के लिए अनुमति देता है। I-SceI एंडोन्यूक्लिएज को ग्लूकोकोर्टिकोइड रिसेप्टर के लिगैंड-बाइंडिंग डोमेन और एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन iRFP713 के साथ फ्रेम में फ्यूज किया जाता है। यह निर्माण ट्रायमसिनोलोन एसिटोनाइड (टीए) की अनुपस्थिति में साइटोप्लाज्मिक है, लेकिन कोशिकाओं के विकास माध्यम में टीए के अलावा नाभिक में तेजी से स्थानांतरित हो जाता है (चित्रा 1 डी)। I-SceI प्रणाली द्वारा DSBs का प्रेरण मजबूत है, जैसा कि 18,19,20 से पहले प्रदर्शित किया गया था। रिपोर्टर जीन प्रतिलेखन को फ्लोरोसेंटली टैग किए गए आरएनए स्टेम-लूप सिस्टम एमएस 2 और पीपी 7 की कल्पना करके समानांतर में निगरानी की जा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रतिकृति, प्रतिलेखन, डीएनए क्षति और डीएनए मरम्मत जैसी आवश्यक जैविक प्रक्रियाओं के बीच संघर्ष को जीनोम अस्थिरता के एक महत्वपूर्ण स्रोत के रूप में पहचाना गया है। इन अध्ययनों ने डीएनए क्षति की साइटों पर प्रतिलेखन की खोज का भी नेतृत्व किया है और डीएनए क्षति मरम्मत प्रक्रियाओं को विनियमित करने में ब्रेक-प्रेरित टेपों के लिए एक कार्यात्मक भूमिका को जिम्मेदार ठहराया है। नए उपकरण और यहां वर्णित प्रोटोकॉल डीएसबी में आरएनए पोल II प्रतिलेखन गतिशीलता की आगे की जांच की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण बिंदु सेल लाइनों की पीढ़ी है जिसमें जीनोम में एकीकृत रिपोर्टर जीन की एक एकल प्रति होती है। यह प्रमुख विशेषता एक ही जीनोमिक लोकस के भीतर कई प्रतियों के साथ एकीकृत कई रिपोर्टर जीनों के प्रतिलेखन द्वारा बनाए गए शोर को समाप्त करती है और प्रतिलेखन गतिशीलता और व्यक्तिगत आरएनए टेपों के गतिज मापदंडों के संग्रह की अनुमति देती है। एकल रिपोर्टर जीन एकीकरण के प्रतिलेखन का निरीक्षण करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीकी आवश्यकता एक माइक्रोस्कोप सिस्टम की उपलब्धता है जो लाइव सेल 4,12 में एमएस 2 या पीपी 7 सिस्टम के साथ लेबल किए गए एकल आरएनए टेपों का पता लगाने की अनुमति देती है। यहां, लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी एक कॉन्फोकल स्पिनिंग डिस्क सिस्टम पर किया जाता है जो एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार होता है, जो 100 mW ठोस-राज्य लेज़रों से सुसज्जित होता है, जो एक ध्वनिक-ऑप्टिक ट्यूनेबल फ़िल्टर के साथ युग्मित होता है जैसा कि कहीं और वर्णित है24। इसके अलावा, पत्रकारों का उपयोग करके एकल डीएसबी में प्रतिलेखन का अध्ययन करने के लिए, व्यक्तिगत कोशिकाओं को उच्चतम समय संकल्प प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए, जिसके लिए कई घंटों के लिए इमेजिंग कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, जिससे यह एक कम थ्रूपुट परख बन जाता है। फिर भी, हम एक पीजो-संचालित माइक्रोस्कोप चरण द्वारा नियंत्रित स्थिति के समानांतर कई कोशिकाओं का निरीक्षण करते हैं। घंटों में लाइव सेल अवलोकन के लिए इष्टतम पर्यावरणीय स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए, नमूना चरण सहित माइक्रोस्कोप शरीर को एक plexiglass पर्यावरण कक्ष के अंदर रखा जाता है। इसके अलावा, कक्ष इनक्यूबेशन एक बंद चरण माइक्रोस्कोप चरण पर लगाया जाता है और सीओ 2 और आर्द्रता आपूर्ति नियंत्रकों से जुड़ा होता है।
प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम इमेजिंग के लिए कोशिकाओं के साथ रुचि के क्षेत्रों का चयन है। इमेजिंग के लिए चिह्नित प्रत्येक XY स्थिति में एक या अधिक कोशिकाएं होनी चाहिए जो धारा 1, तालिका 1, साथ ही चित्रा 2 D, E में वर्णित रिपोर्टर जीन और अभिकर्मक योजना के अनुसार फ्लोरोसेंट आरएनए स्टेम-लूप बाइंडिंग प्रोटीन के साथ अभिकर्मक दिखाती हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं को उज्ज्वल लेबल प्रतिलेखन साइटों को प्रदर्शित करना चाहिए, उन्हें I-SceI-GR-iRFP713 निर्माण के साथ सह-संक्रमित होना चाहिए, और प्रोटीन को शुरू में साइटोप्लाज्म (चित्रा 2 डी और ई) में स्थानीयकृत किया जाना चाहिए।
कोशिकाओं को अनबाउंड फ्लोरोसेंटली टैग किए गए एमएस 2 और / या पीपी 7 कोट प्रोटीन का एक प्रतिदीप्ति तीव्रता स्तर दिखाना चाहिए जो पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर पर एकल लेबल टेपों का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से कम है। उसी समय, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए एमएस 2 और / या पीपी 7 कोट प्रोटीन का एक मजबूत प्रतिदीप्ति तीव्रता स्तर कुछ ब्लीचिंग के कारण बहुत अधिक प्रतिदीप्ति खोने के बिना कम से कम 60 मिनट में इमेजिंग की अनुमति देने के लिए आवश्यक है। अनुभाग 3.7 में वर्णित एक निश्चित श्रेणी के साथ “स्केल छवि प्रदर्शन” का उपयोग उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता स्तर के अनुसार कोशिकाओं के मानकीकृत चयन की अनुमति देने के लिए किया जाता है।
एक दूसरा महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल चरण ग्लास बॉटम डिश के ढक्कन में छोटे छेद के माध्यम से पूर्व-निर्धारित XY पदों पर कोशिकाओं में टीए जोड़ रहा है। ग्लास बॉटम डिश का कोई भी हेरफेर कोशिकाओं की चिह्नित XY स्थिति से बदलाव का कारण होगा और इससे बचा जाना चाहिए। इसलिए, सेलुलर विकास माध्यम में टीए को पतला करते समय माइक्रोपिपेट को सावधानीपूर्वक संभालना पूर्व-चयनित कोशिकाओं के सफल अवलोकन के लिए महत्वपूर्ण है, जैसा कि चित्रा 2 एफ में दिखाया गया है। माइक्रोस्कोप चरण पर घुड़सवार कोशिकाओं में दवाओं को जोड़ने के लिए विभिन्न प्रणालियों के अनुकूलन, जैसे कि एक परफ्यूजन सिस्टम, ट्यूब प्रवेश द्वार और निकास उद्घाटन के साथ कक्ष इनक्यूबेशन एक अलग चरण और दवाओं के प्रशासन के लिए एक पंप या इंजेक्शन प्रणाली की आवश्यकता होगी। अन्य तरीकों जैसे कि कवरस्लिप जैसी निचली सतहों के साथ चैनल स्लाइड के परिणामस्वरूप चैनल में प्रशासित दवाओं का धीमा प्रसार होता है और दवा के अलावा और प्रभाव के बीच एक अतिरिक्त देरी होती है। अंत में, एक चैनल स्लाइड खोलने में असावधान pipetting नमूना स्थिति के रूप में अच्छी तरह से स्थानांतरित कर सकते हैं. इसलिए, ग्लास-बॉटम डिश के ढक्कन में एक कस्टम ड्रिल किए गए छेद के साथ वर्तमान प्रणाली अनुकूलन, कम लागत और विभिन्न विकास मीडिया, दवाओं और घटकों के प्रशासन के लिए उपयुक्त है। छेद का छोटा व्यास और कक्ष के चरण में ह्यूमिडिफाइड वातावरण इनक्यूबेशन भी सेल माध्यम से सूखने से रोकता है।
इस प्रोटोकॉल में एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम डेटा विश्लेषण है, जिसके लिए समय बिंदुओं के मैनुअल निरीक्षण की आवश्यकता होती है जब डीएसबी के प्रेरण के कारण प्रतिलेखन बंद हो जाता है। प्रतिलेखन को समाप्त करने का समय बिंदु रिपोर्टर जीन प्रतिलेखन के पहले उज्ज्वल लेबल वाली साइट से अंतिम टेपों को जारी करके इंगित किया जाता है। इसी तरह, ब्रेक-प्रेरित प्रतिलेखन दीक्षा की घटनाओं को एकल फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एमआरएनए के अपेक्षाकृत कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ व्यक्तिगत प्रतिलेखन घटनाओं का पता लगाने के लिए देखभाल के साथ निरीक्षण किया जाना चाहिए।
प्रेरित डीएसबी की मरम्मत की गतिशीलता इन पत्रकारों का उपयोग करके उत्पन्न डेटा के विश्लेषण के लिए जटिलता की एक अतिरिक्त परत जोड़ती है, उन्हें डीएसबी के प्रेरण के तुरंत बाद पहले मिनट तक सीमित करती है। रिपोर्टर जीन की ट्रांसजेनिक प्रकृति और MS2 और PP7 स्टेम-लूप सरणियों की पुनरावृत्ति-समृद्ध प्रकृति एक अद्वितीय क्रोमैटिन परिदृश्य को इकट्ठा कर सकती है, जो स्थिर ब्रेक-प्रेरित प्रतिलेखन कार्यक्रमों की स्थापना के साथ हस्तक्षेप कर सकती है। फिर भी, आयनीकरण- या यूवी-विकिरण की तुलना में, रिपोर्टर जीन में डीएसबी के आई-एससीईआई मध्यस्थता प्रेरण व्यक्तिगत डीएसबी में प्रतिलेखन की जांच करने के लिए एक बहुत अधिक मजबूत प्रणाली है।
I-CreI, I-PpoI, या AsiSI जैसे विभिन्न एंडोन्यूक्लिएज सिस्टम जिनके पास मानव जीनोम के भीतर अतिरिक्त मान्यता साइटें हैं या नहीं हैं, उन्हें DSBs उत्पन्न करने की संभावित उच्च दक्षता के लिए वर्तमान रिपोर्टर जीन सिस्टम के साथ जोड़ा जा सकता है। हालांकि, उन्हें पहले रिपोर्टर जीन में एंडोन्यूक्लिएज मान्यता साइट को पेश करने की आवश्यकता होती है। दूसरे, उनके पास व्यक्तिगत कोशिकाओं में डीएसबी के समय और दक्षता प्रेरण पर एक समान परिवर्तनशीलता हो सकती है। दूसरी ओर, एंडोन्यूक्लिएज मान्यता साइटों की अग्रानुक्रम प्रतियां डालने से डीएसबी प्रेरण की दक्षता बढ़ सकती है। इसके अलावा, विभिन्न सेल लाइनों में प्रस्तुत रिपोर्टर जीन सिस्टम का परीक्षण विभिन्न सेलुलर पृष्ठभूमि के बीच डीएसबी साइटों पर प्रतिलेखन गतिशीलता की तुलना और कैंसर कोशिकाओं, प्राथमिक कोशिकाओं और विभेदित गैर-साइकिल चालन कोशिकाओं जैसे विभिन्न डीएनए क्षति मरम्मत मार्गों की उपलब्धता की अनुमति देगा। हालांकि, रिपोर्टर जीन का निर्माण Flp / FRT प्रणाली के साथ संगत होने के लिए वर्तमान में उपलब्ध Flp / FRT होस्ट सेल लाइनों में एकीकरण को सीमित कर रहा है।
माइक्रोस्कोपी-आधारित अनुप्रयोगों के अलावा, वर्तमान रिपोर्टर जीन को जैव रासायनिक assays के साथ भी जोड़ा जा सकता है, जैसे कि क्रोमैटिन immunoprecipitation, एक एकल DSB के लिए डीएनए मरम्मत या प्रतिलेखन कारकों की भर्ती का अध्ययन करने के लिए या DSB साइट के चारों ओर न्यूक्लियोसोम अधिभोग, हिस्टोन संशोधनों और क्रोमैटिन राज्य का आकलन करने के लिए। इसके अलावा, विभिन्न रिपोर्टर प्रणालियों के साथ एक संयोजन डीएनए क्षति और जीनोम संगठन या डीएनए प्रतिकृति जैसी प्रक्रियाओं के बीच कार्यात्मक लिंक के अध्ययन की अनुमति देगा।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्लास्मिड और अभिकर्मकों के उपहारों के लिए आरएच सिंगर, जे.ए. चाओ, टी. मिस्टेली, एम. कार्मो-फोन्सेका को धन्यवाद देते हैं। हम भी आईएमएम Bioimaging सुविधा कर्मचारियों, ए Temudo, ए Nascimento, और जे रिनो, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ऋणी हैं. इस काम को PTDC / MED-OUT / 32271 /2017, PTDC / BIA-MOL / 30438/2017 और PTDC / MED-OUT / 4301/2020 द्वारा Fundação पैरा ए Ciência e a Tecnologia (FCT), पुर्तगाल और LISBOA-01-0145-FEDER-007391 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो कि पोर लिसिओ के माध्यम से फेडर द्वारा सह-वित्त पोषित किया गया था। यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (राइबोमेड 857119) से भी धन प्राप्त हुआ था। एमए एफसीटी पीएचडी फैलोशिप 2020.05899.BD के प्राप्तकर्ता हैं।
Materials
| 100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
| 3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
| Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
| CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
| Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
| I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
| Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
| Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
| MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
| microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
| pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
| SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
| triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |
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