1. הכנה וזיהוי של תאים למיקרוסקופיה של תאים חיים הכן בקבוקון תרבית תאים בגודל 25 ס”מ2 של קו התאים של הכתב (EX2, EX2-AS או PROM) עם 5 מ”ל של DMEM כדי להשיג השפעה של 80-90% ביום שלפני ניסוי המיקרוסקופיה של התא החי. שאפו את המדיום עם פיפטה מבקבוק תרבית התאים 25 ס”מ2 ושטפו את התאים עם 2.5 מ”ל של 1x PBS. הוסף 1 מ”ל של טריפסין-EDTA (0.05%) ודגרה ב 37 °C (2-3 דקות עבור ניתוק התא. לאחר ניתוק התא, להוסיף 4 מ”ל של DMEM ללא פנול אדום המכיל חיץ HEPES, בתוספת 10% (v/ v) סרום בקר עוברי מופשט פחם, בעדינות resuspend התאים. צלחת 1 מ”ל של פתרון התא בצלחת עגולה 35 מ”מ עם 10 מ”מ זכוכית תחתון באר (קוטר מס ‘1.5) הומוגניזציה. אחסן את המנה העגולה בקוברות 35 מ”מ בתוך צלחת תרבית תאים סטנדרטית של 100 מ”מ ודגר אותה ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2. ~ 6 שעות לאחר זריעה, לבצע את ההדבקה של התאים בצלחת התחתונה של הזכוכית. עבור כל תערובת טרנספקטו, הכינו שני פתרונות באופן הבא: בצינור microcentrifuge 1.5 מ”ל, להכין פתרון A המכיל 150 μL של מדיום חיוני מינימלי בסרום מופחת (MEM), DNA plasmid (כמתואר בטבלה 1), ו 2.5 מיקרוגרם / μL של DNA של ריאגנט עוזר טרנספקטי (ראה טבלה של חומרים). במקביל, להכין פתרון B, המכיל 150 μL של MEM בסרום מופחת ו 1.5 מיקרוגרם / μL DNA של ריאגנט transfection מבוסס שומנים (ראה טבלה של חומרים). לדגור על שני הפתרונות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות את פתרון A לפתרון B ודגרו 20 דקות ב-RT. כדי להעביר את התאים, להוסיף 300 μL של פתרון A + B dropwise לכל מנה ולהפיץ בעדינות. לאחסן את צלחת התחתונה זכוכית בתוך צלחת תרבית תאים סטנדרטית 100 מ”מ ודגור אותו ב 37 °C (5 °F) באווירה לחה עם 5% CO2. הכן צינור microcentrifuge 1.5 מ”ל עם 200 μL של DMEM עם HEPES, ללא פנול אדום בתוספת 10% (v / v) סרום בקר עוברי מופשט פחם ולהוסיף ת”א לריכוז של 7.5 x 10-7 M. 2. התקנה ניסיונית הגדר את הטמפרטורה של תא הדגירה הגדול של מיקרוסקופ פרספקס ותא הדגירה של השלב העליון ל -37 מעלות צלזיוס ביחידת הבקרה המשותפת. הגדר את התנאים הסביבתיים בתוך תא הדגירה של הבמה ל-5% CO2 ו-100% לחות.הערה: יש להגדיר את כלוב המיקרוסקופ וטמפרטורת האינקובטור של השלב לפחות שעה אחת לפני תחילת הניסוי כדי לאפשר חימום של המערכת השלמה כדי למזער את תנודות הטמפרטורה. הפעל את כל יחידות בקרת המיקרוסקופ האחרות בו-זמנית. לגרום את התמלול של הגנים הכתב על ידי הוספת דוקסיציקלין (0.5 מיקרוגרם / מ”ל) למדיום הצמיחה ולערבב בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם micropipette 200 μL ~ 1 שעה לפני תחילת התצפית מיקרוסקופיה.הערה: שמור את צלחת תחתית הזכוכית עם התאים transfected הוא בתוך צלחת תרבית תאים סטנדרטית 100 מ”מ לטיפול קל והובלה מתרבית התא לחדר המיקרוסקופ במיכל קלקר כדי לשמור על הטמפרטורה יציבה ככל האפשר. להעביר את התאים למיקרוסקופ לפחות 30 דקות לפני תחילת התצפית ועם ההגעה, מניחים את צלחת 100 מ”מ עם התאים מיד בתוך תא הדגירה מיקרוסקופ גדול מחומם מראש. מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה עם ת”א מדוללת מראש מהשלב 1.7. בתוך התא הסביבתי המיקרוסקופ הגדול כדי להתחמם עד 37 °C (70 °F). החליפו את המכסה של צלחת הזכוכית התחתונה בדומה לזו שהוכנה בעבר בחור בקוטר 3 מ”מ שנקדח במכסה (איור 2A).הערה: ת”א תתווסף מאוחר יותר לתאים דרך החור הקטן במכסה מבלי לתמרן את המנה המותקנת על במת המיקרוסקופ. בחר את המטרה טבילת שמן 100x (אובייקט אפוכרומטי, 1.4 צמצם מספרי) בלוח הבקרה של המיקרוסקופ. החל טיפה של שמן טבילה על המטרה. מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם התאים בתוך תא הדגירה של שלב המיקרוסקופ ונעלו אותה במקומה. סגור את המכסה של חממת הבמה ואת כל הדלתות של דיור מיקרוסקופ. הפעל את תוכנת ההפעלה והבקרה של המיקרוסקופ, פתח את החלון בקרת מיקוד (איור 2B), לחץ על החלונית טווח ובחלונית בחירת פליטה , לחץ על התיבה 100% עין כדי להגדיר את נתיב הקרן העין לתצפית מדגם ישיר בעין. בתפריט ערכת מסננים , עבור לסט מסנן עין ולחץ על ברייטפילד ולחץ על לחצן פתח את ברייטפילד . הזז את מטרת המיקרוסקופ לכיוון צלחת התחתונה של הזכוכית עד שהשמן נוגע בכוס. ואז להסתכל דרך המשקפת ולהתמקד באופן ידני במישור של התאים. כבה את לחצן פתח את ברייטפילד . השאירו את התאים למשך 30 דקות לפני תחילת התצפיות הניסיוניות כדי להסתגל לתנאים סביבתיים ולמנוע סחף מוקדי במהלך הדמיה על ידי שיפועי טמפרטורה. מניחים מיקרופיפט 200 μL 200 טיפים מסנן μL מוכן לשימוש בצד בטמפרטורת החדר. 3. רכישת תמונות בחלון ‘בקרת מיקוד’ של תוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר את עוצמת הלייזר ל-5% והזן ערך של 50 אלפיות שני לזמן החשיפה (איור 2B). פתחו את חלון הלכידה כדי להתאים את ההגדרות לביצוע רכישת תמונה אוטומטית של מעידות זמן תלת-ממדיות (איור 2C). בחר את סוג רכישת לכידת 3D והגדר 12 עד 16 פרוסות אופטיות המופרדות באמצעות 0.4 מיקרומטר, סמן את תיבות הסימון של טווח סביב הנוכחי וחזר למיקום הנוכחי לאחר הלכידה. בחלונית לכידת Timelapse , הזן ערך של 120 עבור # נקודות הזמן ו- 30 שניות עבור מרווח הזמן. בחר את מסנן הקונפוקלי שנקבע בהתאם לתוויות חלבון פלואורסצנטיות עם λ = 488 ננומטר עבור GFP, λ = 561 ננומטר עבור TagRFPt, ו – λ = 640 ננומטר עבור iRFP713 והגדר את זמן החשיפה עבור כל ערוץ ל – 50 ms. השתמש בהגדרה Current עבור כוח הלייזר כדי להשתמש בערך של 5% שנבחרו בחלון המוקד (איור 2C). בחלון ‘בקרת מיקוד’ , עבור לחלונית ‘מצלמה ‘, בחר בפקד תצוגת התמונה ‘שנה קנה מידה ‘ ובחר בלחצן ידני כדי להגדיר טווח קבוע של עוצמות תמונה שיוצגו. הזן ערכים עבור נמוך: 500 וגבוה: 5000 (ראה איור 2B).הערה: הגדרה זו מגבילה את הטווח הדינמי של לכידת המצלמה המוצגת בתצוגה החיה כדי לבחור תאים באותו טווח של עוצמות פלואורסצנטיות (איור 2D). בחר את התאים להדמיה תלת-ממדית של אתרי שעתוק בעת אינדוקציה של DSB. מסך התאים ובחר שלושה שדות תצוגה בהתאם לתנאים המתוארים בדיון. התמקד בכל תא שנבחר שהיה ממוקם בעבר במרכז שדה הראייה עם אתר התמלול במישור האמצעי של מחסנית Z.הערה: מיקוד התא ואתר התמלול ב- XYZ מתאים לתנועה מסוימת של התא. סמן כל מיקום XYZ בחלונית XY של חלון בקרת מיקוד על-ידי לחיצה על קבע נקודת.הערה: בקר שוב בעמדות שנבחרו 2-3 פעמים במהלך 5 הדקות הבאות כדי לאשר תמלול רציף של הגנים הכתבים ויציבות מיקום יחסית של מיקומי התאים בממדי XYZ. הוסף 200 μL של ת”א מדולל מראש מהשלב 1.7. לתאים כפי שמוצג באיור 2F.הערה: הקפיד מאוד לא לגעת בצלחת התחתית של הכוס או במכסה תוך הוספת הת”א כדי למנוע כל תזוזה מעמדות XY המסומנות. לאחר אינדוקציה של DSB, ודא שהתאים מרוכזים בשדה הראייה, ואתר התמלול נמצא במרכז Z-plane. המיקוד מחדש ועדכון המיקום אמורים להימשך לא יותר מ-1-2 דקות. התחל את הדמיית סדרת הזמן של 3D על-ידי לחיצה על התחל בחלון לכידה . שמור את נתוני ההדמיה בתבנית הנתונים של תוכנת בקרת המיקרוסקופ בכונן הקשיח של מחשב בקרת המיקרוסקופ. 4. ניתוח נתונים פתח את נתוני ההדמיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ וייצוא כקבצים בתבנית TIFF של 16 סיביות. פתח את הקבצים המיוצאים באמצעות תוכנת StaQtool21 . בחרו במצב ‘3D ספוט בודד’ וטענו את קובצי התמונה על-ידי הקשה על ‘עבור’.הערה: סדרת הזמן שנבחרה נפתחת במציג Timelapse של הקרנה מרבית, המציג הקרנה בעוצמה מרבית של ערימת z של נקודת הזמן הראשונה (איור 3A). התאם את תצוגת עוצמת התמונה באמצעות מחוון MAX האנכי בצד שמאל. בחר את נקודת הזמן לניתוח באמצעות המחוון האופקי של נקודת זמן . רחף עם הסמן למיקום אתר התמלול המסומן בתווית לסימון ידני או לשימוש בפונקציה זיהוי אוטומטי ולחץ באתר התמלול המתאים אם זוהו מספר אובייקטים. השתמש בפונקציה מסלול אוטומטי כדי לקבוע את מיקומי XYZ של אתר התמלול לאורך זמן.הערה: אם לא עקבו אחר מיקום נתון כראוי, בחר את אתר התמלול באופן ידני בהתאם למדריך התוכנה StaQtool. לחץ על לחצן אוטומטי כדי לבצע את התאמת גאוס עבור כל נקודת זמן ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת (TFI).הערה: אם פעילות התמלול נפסקת, כלי המעקב נשאר במיקום האחרון שבו זוהה אובייקט מוגבל עקיפה (אתר תמלול שכותרתו). אם התא נע בכיוון XY לאחר שתווית אתר התמלול נעלמת, נדרשת מיקום מחדש ידני של ריבוע החיפוש . לאחר סיום התאמת ערך TFI עבור כל נקודת זמן, לחץ על לחצן סיום timelapse כדי לסגור את קובץ התמונה הנוכחי של סידרת הזמן ולהמשיך לקובץ הבא.הערה: ערכי TFI מיוצאים ונשמרים באופן אוטומטי בקובץ Excel. 5. מדידות וניתוח כיול מיקרוסקופי זרע תאים לתוך 35 מ”מ זכוכית תחתיות מנות ולהעביר עם חלבוני מעיל MS2 ו PP7 מתויגים פלואורסצנטית כמתואר בסעיף 1.הערה: עבור מדידות הכיול, השתמש באותם קווי תאי גן כתב המתוארים במבוא. הוסף 0.5 מיקרוגרם /mL של דוקסיציקלין למדיום הצמיחה של התאים 1 שעות לפני תחילת רכישת התמונה microscopy. הר את צלחת התחתונה זכוכית בתוך תא הדגירה שלב מיקרוסקופ ולהכין את רכישת התמונה כמו קודם (ראה סעיף 2).הערה: המכסה המקורי של צלחת התחתונה של הזכוכית אינו מוחלף בניסויי הכיול. השתמש באותה עוצמת לייזר והגדרות חשיפה כמתואר בנקודה 3.1. קבעו את הגדרות הלכידה לסדרות זמן כפולות (בטלו את הבחירה באפשרות תלת-ממד בחלונית ‘סוג לכידה ‘) והגדירו 120 נקודות זמן במרווחי זמן של 500 אלפיות השנייה בחלונית ‘לכידת Timelapse ‘ (איור 2C).הערה: הגדרת רכישת תמונה זו תגרום לסדרת זמן בתוך מישור אופטי יחיד במרווחי זמן קצרים מאוד. לרכוש עשרות סדרות זמן כיול ממיקומים מרובים כדי ליצור ערכות נתונים לספור כמה מאות מדידות TFI תעתיקים בודדים. לניתוח סידרת זמן הכיול, המר את הקבצים לקבצים בתבנית TIFF של 16 סיביות בהתאם לנקודה 4.1. פתח את הקבצים המיוצאים באמצעות תוכנת StaQtool21 (איור 3). לחץ על לחצן בחר קובץ LOG, בחר את קובץ היומן של סידרת הזמן הדו-ממד המתאימה שנרכשה כמתואר בנקודה 4.2. בחר בתיבת הסימון נקודות מרובות 2D ולחץ על לחצן GO כדי לטעון את סידרת הזמן לתוכנת הניתוח. בחלון מציג Timelapse (איור 3A), ב- PSF FWHM, שדה הקלט מוסיף את הערך המחושב עבור מערכת המיקרוסקופ והמטרה כמתואר21. כדי להתחיל בתהליך הניתוח, לחץ על לחצן זיהוי אוטומטי כדי לזהות את כל האובייקטים המוגבלים לעקיפה עבור נקודת הזמן הנוכחית המוצגת. לאחר מכן, לחץ על התאמה אוטומטית כדי לבצע את התאמת גאוס כדי לקבוע את ערך ה- TFI עבור כל אובייקט (איור 3A). לחלופין, הצבע על הסמן מעל אובייקט מוגבל עקיפה ולחץ כדי לבחור אותו (מופיע עיגול ירוק בתוך ריבוע לבן) ולחץ על לחצן גאוסיאן Fit לבחירה ידנית ולהליך התאמת גאוס.הערה: מומלץ לא לכלול אובייקטים שאינם נספרים, כגון אתרי תמלול בהירים עם מספר תמלילים המתהווים באותו גרעין. לחץ על לחצן סיום הזמן כדי לסיים את השלב הקודם.הערה: התוצאות נשמרות באופן אוטומטי בתבנית קובץ של Microsoft Excel באותה תיקיה שבה נמצא קובץ התמונה. הפעל את מודול הפצות TFI ו- W עבור נקודות מרובות על-ידי לחיצה על הלחצן המתאים (איור 3B). טען קבצי Excel באמצעות לחצן הוסף קובץ והתחל את ניתוח TFI על-ידי לחיצה על לחצן בצע.הערה: הפלט הוא ערך TFI הממוצע שנקבע ממספר תעתיקים בודדים שנמדדו TFIs. התחל את ניתוח W על-ידי הוספת PSF FWHM ששימש בעבר בנקודה 5.10. ולחץ על לחצן עבור באמצעות ערך ברירת המחדל עבור הסל.הערה: הפרמטר W הוא בקרת איכות עבור מדידות TFI תעתיק יחיד כדי לעמוד בערך PSF FWHM הנכון עבור מערכת המיקרוסקופ המשמשת. 6. מיזוג נתונים וכיול הזן את ערכי TFI מסדרת הזמן שהתקבלו מגיליון Excel שנשמר בנקודה 4.8. לתוך גיליון Excel חדש ולחלק כל ערך נקודת פעם על ידי TFI הממוצע עבור תמלילים בודדים שהושגו בנקודה 5.15.הערה: לתקנון תהליך זה, נעשה שימוש טפסי תבנית Excel שהוכנו בהתאמה אישית.