JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Live-Cell Imaging van transcriptionele activiteit bij DNA Double-Strand Breaks

Published: September 20, 2021
doi:
10.3791/62968
, , ,
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes,Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Summary

Dit protocol presenteert een nieuw reporter-gensysteem en de experimentele opstelling om transcriptie te detecteren bij DNA-dubbelstrengsbreuken met gevoeligheid van één molecuul.

Abstract

DNA dubbelstrengs breuken (DSB) zijn de meest ernstige vorm van DNA-schade. Ondanks de catastrofale gevolgen voor de genoomintegriteit, blijft het tot nu toe ongrijpbaar hoe DSB’s transcriptie beïnvloeden. Een reden hiervoor was het ontbreken van geschikte tools om gelijktijdig transcriptie en de inductie van een genic DSB met voldoende temporele en ruimtelijke resolutie te monitoren. Dit werk beschrijft een reeks nieuwe verslaggevers die transcriptie in levende cellen direct visualiseren onmiddellijk na de inductie van een DSB in de DNA-sjabloon. Bacteriofaag RNA-stamlussen worden gebruikt om de transcriptie te controleren met gevoeligheid voor één molecuul. Voor het richten van de DSB op een specifiek gengebied, zijn de reportergenen ontworpen om een enkele herkenningssequentie van de homing endonuclease I-SceI te bevatten, anders afwezig in het menselijk genoom. Een enkele kopie van elk reporter-gen werd geïntegreerd in het genoom van menselijke cellijnen. Dit experimentele systeem maakt de detectie mogelijk van enkele RNA-moleculen die worden gegenereerd door de canonieke gentranscriptie of door DNA-break-geïnduceerde transcriptie-initiatie. Deze verslaggevers bieden een ongekende kans om de wederzijdse interacties tussen transcriptie en DNA-schade te interpreteren en om tot nu toe niet-gewaardeerde aspecten van DNA-break-geïnduceerde transcriptie te onthullen.

Introduction

DNA dubbelstrengsbreuken (DSB’s) zijn toxische DNA-laesies die de celfunctie verstoren en bijdragen aan de opkomst van verschillende ziekten en veroudering1. Mutaties als gevolg van het onnauwkeurige herstel van DSB’s beïnvloeden de genexpressie en leggen de basis voor de functionele achteruitgang van de cel. De emergente opvatting dat DSB’s de novo break-geïnduceerde transcriptie op de laesieplaats2,3,4,5,6,7 aansturen, suggereert dat DSB’s ook de cellulaire functie kunnen beïnvloeden door break-geïnduceerde RNA’s. Verschillende recente studies geven aan dat DSB’s voldoende zijn om geprogrammeerde (bijv. stimulus-induceerbare genen) en ongeplande (bijv. bij niet-canonieke promotors) transcriptie4,5,7 te initiëren. Ondanks verschillende studies die de verbanden tussen DNA-schade en transcriptie onderzochten, bleef het veld echter nog steeds achter in zijn capaciteit om een nauwkeurige (d.w.z. single-molecule) karakterisering van de transcriptionele gebeurtenissen op DNA-breukplaatsen te leveren. Een belangrijke reden hiervoor was het gebrek aan geschikte experimentele hulpmiddelen. Celbestraling (γ-stralen, röntgenstralen, zware ionen) en medicamenteuze behandelingen (bijv. Topoisomeraseremmers of intercalerende middelen) missen ruimtelijke precisie en induceren DNA-laesies anders dan DSB’s, waaronder enkelstrengsbreuken en DNA-adducten8. Endonucleasen, zoals I-PpoI en AsiSI, genereren locus-specifieke DSB’s, maar zijn niet gecombineerd met een systeem dat gelijktijdige live-celvisualisatie van transcriptie op een enkele locus met hoge temporele precisie mogelijk maakt8. Om deze beperking te omzeilen, heeft ons lab het voortouw genomen bij de ontwikkeling van een reeks geavanceerde verslaggevers die transcriptie direct visualiseren met een resolutie van één molecuul bij de gecontroleerde inductie van een unieke DSB4. Hier beschrijven we deze verslaggevers, bieden we een gedetailleerd protocol voor live-cell imaging van transcriptie bij DSB’s en tonen we gegevens die transcriptie-initiatie onthullen bij een enkele DSB.

De reportergensystemen die in dit protocol worden gebruikt, zijn gebaseerd op het goed gekarakteriseerde muis IgM-reportergen en bevatten de exonen M1 en M2 van de membraangebonden vorm (μm) van de IgM-μ zware keten9,10,11. Een hybride intron scheidt de twee exonen met het sterke adenovirus major late transcript (AdML) PY tract12. De expressie van de reportergenen wordt gecontroleerd door de humane cytomegaloviruspromotor (CMV), waarin twee tandemkopieën van de Tet operator (TetO) sequentie zijn ingebracht. De reportergenen worden elk ingebracht in een plasmidevector die een Flp Recombination Target (FRT) -site bevat en ingevoegd in een specifieke FRT-doellocatie in het genoom van een HEK293-gastheercellijn. Deze cellijn brengt ook constitutief het Tet-repressoreiwit tot expressie om de expressie van het reporter-gen te reguleren via de aan- of afwezigheid van tetracycline / doxycycline. Om visualisatie van de transcriptie van het reportergen mogelijk te maken, werden 24 tandemherhalingen van de MS2-stamlussequentie en 24 tandemherhalingen van de PP7-stengellussequentie op verschillende posities ingebracht met betrekking tot transcriptiestartplaats en exon / intron-structuur van het reporter-gen. De MS2/PP7 RNA-stengellussen vormen zich bij transcriptie en zijn specifiek gebonden door ectopisch tot expressie gebrachte MS2/PP7-vachteiwitten gelabeld met groene en rode fluorescerende eiwitten, een strategie die veel werd gebruikt om transcriptie in beeld te brengen13,14,15. Daarnaast werd een enkele kopie van de 18 bp herkenningssequentie ingevoegd voor het homing endonuclease I-SceI dat direct wordt geflankeerd door de RNA stem-loop sequence arrays in de reporter genen. Standaard kloontechnieken werden gebruikt om alle plasmiden te genereren, het fragment met de I-SceI-24xMS2 stamlus van het PROP reporter gen werd gesynthetiseerd door een commerciële gensynthesedienst.

Het promotor-proximale DSB reporter gen (PROP) werd geconstrueerd door het inbrengen van de I-SceI snijplaats 45 basenparen (bp) stroomafwaarts van de vermeende transcriptie startplaats in exon I, gevolgd door 149 bp tot het begin van de 24x MS2 stem-loop cassette, die de novo was ontworpen met twee afwisselende niet-identieke stam-loop sequenties16 en nog eens vijf niet-repetitieve 20 bp spacersequenties om redundantie te verminderen. De MS2 stem-loop array wordt gevolgd door 72 bp tot het begin van de 1844 bp intron en de 1085 bp exon II tot de splitsings- en polyadenylation site. Het exon II codeert voor een cyaan fluorescerend eiwit (CFP) gefuseerd met een C-terminale peroxisomale targetingsequentie (PTS) van de humane peroxisomale acyl CoA-oxidase om een onafhankelijke screening van de reporter-genexpressie mogelijk te maken (figuur 1A).

Het exon II DSB reporter gen (EX2) bestaat uit een 167 bp exon I gevolgd door het intron en exon II dat codeert voor het CFP-PTS. Verder stroomafwaarts op een afstand van 169 bp werd een cassette met 24x MS2-steel-loops ingebracht, gevolgd door een linkersequentie van 84 bp met een I-SceI-site in het midden, gevolgd door 24x PP7-stengellussen en 221 bp tot de splitsings- en polyadenylation-site17 (figuur 1B).

Ten slotte is het exon II DSB reporter-gen met antisense transcription labeling (EX2AS) gebaseerd op het humane ubiquitine B (UBB) gentranscript UBB-201 en bevat het twee exonen en één intron. De exon I hebben een totale lengte van 1534 bp met een inverse insertie van de 24x MS2 stem-loop sequence. Daarom zal de juiste MS2 stem-loop RNA-sequentie worden getranscribeerd in een antisense richting met betrekking tot de zinstonranscriptie van het reporter-gen van de CMV-promotor. Het intron heeft een lengte van 490 bp, gevolgd door exon II met de I-SceI-site , en een coderend gebied werd ingevoegd voor twee in-frame ubiquitine-subeenheden. Stroomafwaarts van het UBB-gen bevindt zich een sequentie die een 24x PP7-stamlus vormt bij transcriptie van het reporter-gen in een bepaalde richting (figuur 1C).

De voorbijgaande transfectie van een induceerbare constructie van het homing endonuclease I-SceI maakt de gecontroleerde creatie van een DSB op de ingebrachte herkenningsplaats binnen elk reportergen mogelijk18. De I-SceI endonuclease is in beeld gefuseerd met het ligandbindende domein van de glucocorticoïde receptor en een verrood fluorescerend eiwit iRFP713. Dit construct is cytoplasmatisch in afwezigheid van triamcinolonacetonide (TA), maar migreert snel naar de kern na toevoeging van TA aan het groeimedium van de cellen (figuur 1D). De inductie van DSB’s door het I-SceI-systeem is robuust, zoals eerder aangetoond18,19,20. De transcriptie van het reporter-gen kan parallel worden gevolgd door de fluorescerend gelabelde RNA-stamlussystemen MS2 en PP7 te visualiseren.

Protocol

1. Voorbereiding en transfectie van cellen voor levende-celmicroscopie Bereid een celkweekkolf van 25 cm2 van de reporter-cellijn (EX2, EX2-AS of PROM) voor met 5 ml DMEM om 80-90% confluentie te bereiken op de dag vóór het live-cell microscopie-experiment. Zuig het medium op met een pipet uit de celkweekkolf van 25 cm2 en was de cellen met 2,5 ml 1x PBS. Voeg 1 ml trypsine-EDTA (0,05%) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 2-3 minuten voor celloslating. Voeg na celloslating 4 ml DMEM toe zonder fenolrood met HEPES-buffer, aangevuld met 10% (v/v) op houtskool gestript foetaal runderserum, en resuspend de cellen voorzichtig. Plaat 1 ml van de celoplossing in een ronde schaal van 35 mm met een put met glazen bodem van 10 mm (diameter nr. 1.5) en homogeniseer. Bewaar de ronde schaal van 35 mm in een standaard celkweekschaal van 100 mm en incubeer deze bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. ~ 6 uur na het zaaien, transfecteer de cellen in de glazen bodemschaal. Bereid voor elk transfectiemengsel twee oplossingen op de volgende manier: Bereid in een microcentrifugebuis van 1,5 ml oplossing A met 150 μL minimaal essentieel medium (MEM) gereduceerd serum, plasmide-DNA (zoals beschreven in tabel 1) en 2,5 μg/μL DNA van transfectiehelperreagens (zie Materiaaltabel). Bereid tegelijkertijd oplossing B, die 150 μL mem met gereduceerd serum en 1,5 μg/μl DNA van een transfectiereagens op basis van lipiden bevat (zie materiaaltabel). Incubeer beide oplossingen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens voorzichtig oplossing A toe aan oplossing B en incubeer 20 minuten bij RT. Om de cellen te transfecteren, voegt u 300 μL oplossing A +B druppelsgewijs toe aan elke schaal en verdeelt u voorzichtig. Bewaar de glazen bodemschaal in een standaard celkweekschaal van 100 mm en incubeer deze bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. Bereid een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 200 μL DMEM met HEPES, zonder fenolrood aangevuld met 10% (v/v) houtskoolgestript foetaal runderserum en voeg TA toe aan een concentratie van 7,5 x 10-7 M. 2. Experimentele opstelling Stel de temperatuur van de grote plexiglas microscoop incubatiekamer en de bovenste podium incubatiekamer in op 37 °C bij de gemeenschappelijke regeleenheid. Stel de omgevingscondities in de podiumincubatiekamer in op 5% CO2 en 100% vochtigheid.OPMERKING: De microscoopkooi en de temperatuur van de podiumincubator moeten ten minste 1 uur voor aanvang van het experiment worden ingesteld om verwarming van het volledige systeem mogelijk te maken om temperatuurschommelingen te minimaliseren. Start alle andere microscoopbesturings- en bedieningseenheden tegelijkertijd. Induceer de transcriptie van de reportergenen door doxycycline (0,5 μg / ml) aan het groeimedium toe te voegen en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren met een micropipette van 200 μL ~ 1 uur voordat de microscopie-observatie wordt gestart.OPMERKING: Houd de schotel met glazen bodem met de getransfecteerde cellen in een standaard celkweekschaal van 100 mm voor eenvoudige hantering en transport van de celcultuur naar de microscoopruimte in een piepschuimen container om de temperatuur zo stabiel mogelijk te houden. Transporteer de cellen ten minste 30 minuten voordat de waarneming begint naar de microscoop en plaats bij aankomst de 100 mm schaal met de cellen onmiddellijk in de voorverwarmde grote microscoop incubatiekamer. Plaats de microcentrifugebuis met de voorverdunde TA uit stap 1.7. in de grote microscoop omgevingskamer om op te warmen tot 37 °C. Vervang het deksel van de glazen bodemschaal zoals eerder bereid door een gat met een diameter van 3 mm dat in het deksel is geboord (figuur 2A).OPMERKING: De TA wordt later aan de cellen toegevoegd door het kleine gaatje in het deksel zonder de schotel te manipuleren die op het microscooppodium is gemonteerd. Selecteer het 100x (apochromatische objectief, 1,4 numeriek diafragma) olie-onderdompelingsobjectief in het microscoopbedieningspaneel. Breng een druppel dompelolie aan op het doel. Plaats de schotel met glazen bodem met de cellen in de incubatiekamer van de microscoopfase en vergrendel deze op zijn plaats. Sluit het deksel van de podiumincubator en alle deuren van de microscoopbehuizing. Start de bedienings- en besturingssoftware van de microscoop, open het venster Focus Control (figuur 2B), klik op het deelvenster Scope en klik in het deelvenster Emissieselectie op het vak 100% Eye om het oculaire straalpad in te stellen voor directe monsterobservatie met het oog. Schakel in het menu Filterset over naar Oogfilterset , klik op Brightfield en druk op de knop Brightfield openen . Beweeg het microscoopobjectief naar de glazen bodemschaal totdat de olie het glas raakt. Kijk dan door de oculair en stel handmatig scherp op het vlak van de cellen. Schakel de knop Brightfield openen uit . Laat de cellen 30 minuten staan voordat de experimentele waarnemingen worden gestart om zich aan te passen aan omgevingsomstandigheden en focale drift tijdens beeldvorming door temperatuurgradiënten te voorkomen. Leg een 200 μL micropipette en 200 μL filtertips klaar voor gebruik opzij bij kamertemperatuur. 3. Beeldverwerving Stel in het venster Focus Control van de microscoopbesturingssoftware de laserintensiteit in op 5% en voer een waarde van 50 ms in voor de belichtingstijd (figuur 2B). Open het venster Vastleggen om de instellingen aan te passen om een geautomatiseerde beeldacquisitie van driedimensionale (3D) time-lapses uit te voeren (afbeelding 2C). Selecteer het acquisitietype voor 3D-opname en stel 12 tot 16 optische segmenten in, gescheiden door 0,4 μm, vink de selectievakjes bereik rond stroom en Terugkeer naar huidige positie na opname in. Voer in het deelvenster Timelapse Capture de waarde 120 in voor het aantal tijdspunten en 30 s voor het interval. Selecteer de confocale filterset volgens de getransfecteerde fluorescerende eiwitetiketten met λ = 488 nm voor GFP, λ = 561 nm voor TagRFPt en λ = 640 nm voor iRFP713 en stel de belichtingstijd voor elk kanaal in op 50 ms. Gebruik de instelling Stroom voor het laservermogen om de waarde van 5% te gebruiken die is geselecteerd in het focusvenster (afbeelding 2C). Ga in het venster Focus control naar het deelvenster Camera , selecteer het besturingselement Afbeeldingsweergave schalen en kies de knop Handmatig om een vast bereik van beeldintensiteiten in te stellen dat moet worden weergegeven. Voer waarden in voor Laag: 500 en Hoog: 5000 (zie figuur 2B).OPMERKING: Deze instelling beperkt het dynamische bereik van de camera-opname die in de liveweergave wordt weergegeven om cellen te selecteren binnen hetzelfde bereik van fluorescentie-intensiteiten (figuur 2D). Selecteer de cellen voor de 3D time-lapse-beeldvorming van transcriptieplaatsen bij inductie van een DSB. Scherm de cellen en selecteer drie weergavevelden volgens de voorwaarden die in de discussie worden beschreven. Focus elke geselecteerde cel die zich eerder in het midden van het gezichtsveld bevond met de transcriptieplaats in het middelste vlak van de Z-stack.OPMERKING: Het centreren van de cel en de transcriptieplaats in XYZ is geschikt voor enige beweging van de cel. Markeer elke XYZ-positie in het XY-deelvenster van het focusbesturingselement door op Instellen te klikken.OPMERKING: Bezoek de geselecteerde posities 2-3 keer opnieuw gedurende de volgende 5 minuten om de continue transcriptie van de reportergenen en de relatieve positionele stabiliteit van de posities van de cellen in XYZ-dimensies te bevestigen. Voeg 200 μL van de voorverdunde TA uit stap 1.7 toe. naar de cellen zoals weergegeven in figuur 2F.OPMERKING: Let uiterst voorzichtig op dat u de schotel met glazen bodem of het deksel niet aanraakt terwijl u de TA toevoegt om verschuiving van de gemarkeerde XY-posities te voorkomen. Controleer na DSB-inductie of de cellen zich binnen het gezichtsveld bevinden en dat de transcriptieplaats zich in het middelste Z-vlak bevindt. Het opnieuw scherpstellen en de positie-update duurt niet langer dan 1-2 minuten. Start de 3D-tijdreeksbeeldvorming door op Start te klikken in het venster Vastleggen . Sla de beeldgegevens op in het gegevensformaat van de microscoopbesturingssoftware op de harde schijf van de microscoopbesturingscomputer. 4. Data-analyse Open de beeldgegevens in de microscoopbesturingssoftware en exporteer als 16-bits TIFF-bestanden. Open de geëxporteerde bestanden met de StaQtool21 software. Selecteer de Single Spot 3D-modus en laad de afbeeldingsbestanden door op Go te drukken.OPMERKING: De geselecteerde tijdreeks wordt geopend in de Max Projection Timelapse Viewer en toont een maximale intensiteitsprojectie van de z-stack van het eerste tijdspunt (figuur 3A). Pas de weergave van de beeldintensiteit aan met de verticale schuifregelaar MAX aan de linkerkant. Selecteer het tijdspunt dat u wilt analyseren met de horizontale schuifregelaar Tijdpunt . Plaats de muisaanwijzer op de positie van de gelabelde transcriptiesite voor handmatig markeren of gebruik de functie Automatisch detecteren en druk op de betreffende transcriptiesite als er meerdere objecten zijn gedetecteerd. Gebruik de functie Auto Track om de XYZ-posities van de transcriptiesite in de loop van de tijd te bepalen.OPMERKING: Als een bepaalde positie niet correct is bijgehouden, selecteert u de transcriptiesite handmatig volgens de StaQtool-softwarehandleiding. Druk op de autoknop om de Gauss-aanpassing voor elk tijdspunt uit te voeren en de totale fluorescentie-intensiteit (TFI) te meten.OPMERKING: Als de transcriptionele activiteit stopt, blijft het trackinggereedschap op de laatste positie waar een object met diffractiebeperking (een gelabelde transcriptiesite) is gedetecteerd. Als de cel in XY-richting beweegt nadat het label van de transcriptiesite is verdwenen, is een handmatige herpositionering van het zoekvak vereist. Nadat u de aanpassing van de TFI-waarde voor elk tijdspunt hebt voltooid, drukt u op de knop Time-lapse beëindigen om het huidige tijdreeksafbeeldingsbestand te sluiten en door te gaan naar het volgende bestand.OPMERKING: De TFI-waarden worden automatisch geëxporteerd en opgeslagen in een Excel-bestand. 5. Microscopie kalibratie metingen en analyse Zaadcellen in 35 mm glazen bodemschalen en transfecteren met de fluorescerend getagde MS2- en PP7-vachteiwitten zoals beschreven in sectie 1.OPMERKING: Gebruik voor de kalibratiemetingen dezelfde reporter-gencellijnen die in de inleiding worden beschreven. Voeg 0,5 μg/ml doxycycline toe aan het groeimedium van de cellen 1 uur voordat u begint met de microscopiebeeldverwerving. Monteer de glazen bodemschaal in de incubatiekamer van de microscoopfase en bereid de beeldverwerving voor zoals voorheen (zie rubriek 2).OPMERKING: Het originele deksel van de glazen bodemschaal is niet vervangen voor de kalibratie-experimenten. Gebruik dezelfde laserintensiteit en belichtingsinstellingen als beschreven in punt 3.1. Stel de opname-instellingen voor 2D-tijdreeksen in (schakel de optie 3D uit in het deelvenster Opnametype ) en stel 120 tijdpunten in met intervallen van 500 ms in het deelvenster Timelapse-opname (afbeelding 2C).OPMERKING: Deze instelling voor beeldacquisitie resulteert in tijdreeksen binnen een enkel optisch vlak met zeer korte intervallen. Verkrijg tientallen kalibratietijdreeksen vanuit meerdere posities om datasets te genereren om enkele honderden TFI-metingen met één transcript te tellen. Voor de analyse van de kalibratietijdreeks converteert u de bestanden naar 16-bits TIFF-bestanden overeenkomstig punt 4.1. Open de geëxporteerde bestanden met de StaQtool21 software (Figuur 3). Druk op de knop LOG-bestand selecteren , kies het logbestand van de respectieve 2D-tijdreeksen die zijn verkregen zoals beschreven in punt 4.2. Schakel het selectievakje Multiple Spots 2D in en druk op de GO-knop om de tijdreeks in de analysesoftware te laden. In het timelapse-viewervenster (figuur 3A), in de PSF FWHM, voegt het invoerveld de waarde in die is berekend voor het microscoopsysteem en het objectief zoals beschreven21. Als u het analyseproces wilt starten, drukt u op de knop Automatisch detecteren om alle objecten met diffractiebeperking voor het huidige weergegeven tijdstip te detecteren. Klik vervolgens op AutoFit om de Gaussiaanse aanpassing uit te voeren om de TFI-waarde voor elk object te bepalen (figuur 3A). U kunt ook de cursor op een object met diffractiebeperking plaatsen en erop klikken om het te selecteren (groene cirkel in een wit vierkant wordt weergegeven) en op de knop Gauss-passen op de gauss-knop drukken voor de handmatige selectie en Gauss-aanpassingsprocedure.OPMERKING: De laatste modus wordt aanbevolen om objecten uit te sluiten die niet zijn geteld, zoals heldere transcriptieplaatsen met verschillende ontluikende transcripten die in dezelfde kern aanwezig zijn. Druk op de knop Time-lapse beëindigen om de vorige stap te voltooien.OPMERKING: De resultaten worden automatisch opgeslagen in een Microsoft Excel-bestandsindeling in dezelfde map als het afbeeldingsbestand. Start de TFI- en W-distributiemodule voor meerdere plaatsen door op de betreffende knop te drukken (figuur 3B). Laad Excel-bestanden via de knop Bestand toevoegen en start de TFI-analyse door op de knop Ga te drukken.OPMERKING: De uitvoer is de gemiddelde TFI-waarde bepaald op basis van meerdere gemeten enkelvoudige transcripties TFI’s. Start de W-analyse door de psf-FWHM in te voegen die eerder in punt 5.10 werd gebruikt. en druk op de knop Ga met de standaardwaarde voor de prullenbak.OPMERKING: De W-parameter is kwaliteitscontrole voor de TFI-metingen met één transcript om te voldoen aan de juiste PSF FWHM-waarde voor het gebruikte microscoopsysteem. 6. Gegevens en kalibratie samenvoegen Voer de TFI-waarden van de tijdreeks in die zijn verkregen uit het Excel-blad dat is opgeslagen in punt 4.8. in een nieuw Excel-blad en deel elke tijdspuntwaarde door de gemiddelde TFI voor afzonderlijke transcripties verkregen in punt 5.15.OPMERKING: Voor het standaardiseren van dit proces zijn aangepaste Excel-sjabloonformulieren gebruikt.

Representative Results

De cellijnen die de reportergenen bevatten die in figuur 1A-C worden beschreven, maken de studie van transcriptiedynamica bij een enkele DSB in levende cellen mogelijk. De getallen in figuur 1A-C onder elke grafische reportergenrepresentatie geven de lengte in kilobaseparen (kbp) aan. CMV geeft de cytomegaloviruspromotor aan, TetO is de Tet-operatorsequenties, pA benadrukt de 3′-splitsing en poly-adenylatieplaats aan het geneinde. CFP-PTS is het gecodeerde cyaan fluorescerende eiwit gefuseerd tot een peroxisomaal richtsignaal en 2UBB is de gecodeerde menselijke ubiquitine B-tandemeenheid. Door het volgen van het protocol en de analyseprocedures die hierboven zijn beschreven, is het mogelijk om grafieken te verkrijgen die het aantal fluorescerend gelabelde reporter-gentranscripten in de loop van de tijd weergeven, met een temporele resolutie van seconden over perioden van maximaal uren (figuur 4A-D). De grafiek in figuur 4A toont het tijdsverloop van TFI-waarden van een PROM reporter-gentranscriptiesite gelabeld door de accumulatie van MS2-GFP-moleculen op ontluikende transcripten. Deze specifieke grafiek vertegenwoordigt een controle-experiment zonder TA-toevoeging; daarom wordt er geen DSB geïnduceerd. Transcriptie gaat verder met burst-achtige pieken en 2-8 transcripties per keer over de gehele observatieperiode van 60 minuten. Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor de EX2- en EX2-AS-reportergenen (gegevens die hier niet worden weergegeven)4. De inductie van een enkele DSB in de reportergenen (met behulp van I-SceI-GR-iRFP) maakt het mogelijk om de impact van de DSB op de lopende transcriptie van reportergenen te bestuderen en de monitoring van transcriptiegebeurtenissen die voortkomen uit de DSB-site, namelijk break-geïnduceerde transcriptie (figuur 4B-D). De dynamiek van DNA-break-geïnduceerde transcriptie is afhankelijk van de locatie van de DSB in het genDe inductie van een enkele DSB door I-SceI-GR-iRFP in het reporter-gen met een promotor-proximale I-SceI-herkenningsplaats leidt tot transcriptionele uitschakeling van het reporter-gen na ongeveer 11 minuten na TA-additie, en de transcriptie wordt niet hersteld binnen de observatieperiode van 60 minuten (figuur 4B). Bij het observeren van de EX2 reporter-gentranscriptie werd volledige onderdrukking van de canonieke promotorgestuurde transcriptie gedetecteerd door een gelijktijdig volledig verlies van zowel MS2-GFP- als PP7-RFP-signalen ongeveer 30 minuten na TA-toevoeging. Binnen 10 minuten wordt de transcriptie echter opnieuw gestart, zoals blijkt uit het opnieuw verschijnen van pieken van PP7-RFP-fluorescentie. Het volledige herstel van het PP7-RFP-signaal (en niet de MS2-GFP-fluorescentie) toont break-geïnduceerde transcriptie-initiatie (figuur 4C). De break-geïnduceerde transcriptie is niet stabiel over lange perioden; het lijkt burst-achtig en lage piekintensiteit, wat aangeeft dat slechts een paar break-geïnduceerde transcripties werden geïnitieerd vanaf de DSB-site. Het EX2AS reporter-gen, dat een 24x PP7 stem-loop array bevat in exon II stroomafwaarts van de I-SceI-site om de zintuigtranscriptie te detecteren, toont de canonieke promotor-gedreven transcriptie die binnen het EX2AS-reportergen eindigt binnen ongeveer 25 minuten na TA-toevoeging. Het wordt vervolgens vervangen door antisense break-geïnduceerde transcriptie, zoals blijkt uit de accumulatie van MS2-GFP-eiwitbinding aan RNA gegenereerd uit antisense MS2-stamlussequenties (figuur 4D). De antisense transcriptionele activiteit was afwezig vóór de onderbreking van de zintuigtranscriptie als gevolg van de inductie van de DSB en laat in dit voorbeeld zien dat verschillende transcripties binnen ongeveer 15 minuten vanaf de pauzeplaats werden geïnitieerd. De representatieve gegevens die hier zijn verkregen, tonen aan dat DSB’s verschillende effecten hebben op transcriptie, afhankelijk van hun locatie in het gen, zoals onlangs werd gemeld4. De gegevens onthullen ook een cel-tot-celvariabiliteit in de timing van de DSB-inductie door I-SceI-GR-iRFP, die varieert van 12 tot 30 minuten na TA-toevoeging. Bovendien maakt de detectie van individuele transcripten de ontdekking van cel tot cel mogelijk en breekt siteverschillen naar de intensiteit van de break-geïnduceerde transcriptionele activiteit. De break-geïnduceerde transcriptie wordt alleen gedetecteerd bij DSB’s in het gen. Het is afwezig bij promotor-proximale DSB’s, waar de canonieke transcriptie stopt op een DSB voor de resterende observatieperiode. Figuur 1: Reporter-genen en het systeem om DNA-dubbelstrengsbreuken te induceren. De schematische weergave in (A) tot en met (C) toont de structuur van de drie reportergenen die worden gebruikt om transcriptie te bestuderen bij inductie van een DNA-dubbelstrengsbreuk. Het reportergen met de promotor-proximale I-SceI-site in het eerste exon (PROM) stroomafwaarts geflankeerd door een 24x MS2 stem-loop (MS2-SL) sequence array is afgebeeld in (A). Het reportergen met de I-SceI-site in het tweede exon (EX2) stroomopwaarts geflankeerd door een 24x MS2 stem-loop sequentie en stroomafwaarts door een 24x PP7 stem-loop (PP7-SL) array wordt getoond in (B). Het reporter-gen met de I-SceI-site in exon II met een anti-parallelle insertie van de 24x MS2-stamlussequentie stroomopwaarts van de I-SceI-site om antisense-transcriptie (EX2-AS) te detecteren, wordt weergegeven in (C). De functie van de I-SceI-GR-iRFP fusie-eiwitconstructie wordt weergegeven in (D) door een grafische weergave en bijbehorende afbeeldingen van levende cellen hieronder. Bij voorbijgaande expressie van het construct (rode kleur) in de cellijnen van het reporter-gen is het eiwit uitsluitend cytoplasmatisch, wat een voortijdige splitsing van de doelplaats door de I-SceI-endonuclease voorkomt. Na toevoeging van TA begint het fusie-eiwit te migreren naar de celkern (aangegeven door een stippellijn) en begint het zich op te hopen tussen 5-15 minuten. Scalebar = 10 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Cellen selecteren voor 3D time-lapse beeldvorming van transcriptieplaatsen. De foto in (A) toont een 35 mm glazen bodemschaal die wordt gebruikt voor de live celbeeldvorming, met een aangepast aangepast deksel, waarin een gat van 3 mm diameter werd geboord om de TA verdund in groeimedium direct toe te voegen. De locatie van het gat is gemarkeerd met een rode cirkel. Het paneel in (B) toont een screenshot van het “Focus” -venster van de microscoopbesturingssoftware om de live view-belichtingstijd, filterinstelling, laserintensiteit en schaalbeeldweergave in te stellen om cellen te screenen voor daaropvolgende time-lapse-beeldvorming in (C), de schermafbeelding van het bijbehorende “Capture” -venster om alle instellingen aan te passen voor de 3D-timelapse-acquisitie van live cellen. De specifieke instellingen voor de deelvensters Filter, Opnametype, Time-Lapse-opname en 3D-opname worden beschreven in sectie 3. In de hier getoonde weergave worden de instellingen aangepast om een 3D-time-lapse te verkrijgen van de PROM reporter-genlijn getransfecteerd met de MS2-GFP- en I-SceI-GR-iRFP-constructen voor beeldvormingstrascriptie bij inductie van een DNA-dubbelstrengsbreuk in het promotor-proximale gebied van het reporter-gen. Het beeld in (D) is samengevoegd voor de GFP- en iRFP-kanalen en toont een gezichtsveld zoals gezien door het microscoopsysteem, met verschillende cellen van de 293-PROM reporter gen cellijn. De cellen werden gecotransfecteerd met het tandemdimeer MS2-coatingeiwit geconstrueerd tot een nucleaire lokalisatiesequentie, twee groene fluorescerende eiwitten (GFP-MS2CP) en de I-SceI-GR-iRFP-constructie. Verschillende cellen vertonen expressie van het GFP-MS2CP-construct, waardoor de kernen en het I-SceI-GR-iRFP-construct het cytoplasma benadrukken. Het onderbroken vierkant geeft het vergrote gebied aan dat wordt weergegeven in (E). Voor de 3D time-lapse beeldvorming worden cellen geselecteerd volgens de eisen die in de Discussie worden gesteld, zoals de cel met de grotere kern in het vergrote gebied in (D). Deze cel is getransfecteerd met beide fluorescerende constructen en toont een helder gelabelde transcriptieplaats (pijlpunt) door de GFP-MS2CP te accumuleren op de novo getranscribeerde reportergen pre-mRNA’s (linker afbeelding). Het groeimedium van de cellen bevat geen TA; daarom is het I-SceI-GR-iRFP-construct uitsluitend cytoplasmatisch (rechter afbeelding). In (F) is de glazen bodemschaal gemonteerd in de incubatiekamer van de microscoopfase voor 3D-time-lapse-beeldvormingsexperimenten en uitgerust met het aangepaste deksel met het TA-laadgat. De micropipettepunt van 200 μL wordt voorzichtig in het gat ingebracht om de verdunde TA op het groeimedium van de cellen aan te brengen. Scalebar = 10 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Beeldacquisitie- en analysesoftware. Het paneel in (A) toont een screenshot van de STaQTool: Spot tracking and quantification tool. De afbeelding toont een voorbeeldtijdreeks van de PROM reporter-gencellijn met gelabelde transcriptieplaats gemarkeerd met een groene cirkel / wit vierkant in de maximale intensiteitsprojectieweergave in het midden. De vensters aan de rechterkant tonen een vergrote weergave van de geselecteerde transcriptieplaatsvlek, de bijbehorende 3D-gearceerde intensiteitsoppervlakplot met het 2D Gaussiaanse fitraster voor het huidige tijdspunt, evenals plots van de transcriptieplaatsspot Z-positie binnen de z-stack, de Gaussiaanse fitbreedte (W) en de TFI-meting in de loop van de tijd. De microscopische afbeelding in (B) toont een ingezoomd enkel optisch vlak van een kern van een PROM reporter gen cellijn getransfecteerd met MS2-GFP. Het beeld vertegenwoordigt een eenmalig punt van een 2D-kalibratietijdreeks met 120 tijdpunten. De kern toont verschillende fluorescerend gelabelde transcripten die verschijnen als diffractie-beperkte objecten in het nucleoplasma (gemarkeerd door witte vierkanten). Het rechterdeelvenster toont een screenshot van de TFI- en W-distributietool in de STaQTool om meerdere plekken in 2D-time-lapse-acquisities te analyseren. In deze voorbeeldanalyse detecteerde de tool 408 diffractie-beperkte vlekken die reporter-gentranscripten vertegenwoordigen die zijn gelabeld met MS2-GFP en die diffunderen in het nucleoplasma. De grafieken aan de rechterkant tonen de TFI en Gaussische fit width verdeling histogrammen van de objecten en de Gaussiaanse fit curven. De TFI- en W-gemiddelde waarden die zijn afgeleid van de positie van de middelste piek van de Gaussiaanse fitcurve en de berekende betrouwbaarheidsintervallen worden weergegeven in het betreffende deelvenster. Scalebar = 10 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Representatieve resultaten van transcriptiedetectie op plaatsen van DNA-dubbelstrengsbreuken. De grafieken in (A) tot en met (D) vertegenwoordigen de gekalibreerde TFI-curve van één transcriptieplaats in de loop van de tijd. De TFI-waarden worden geconverteerd naar transcripten met behulp van de gemiddelde TFI van enkele transcripten gemeten in de kalibratie-experimenten voor de respectieve reporter-genconstruct en fluorescerend gelabeld RNA-stamlusbindend eiwit MS2 of PP7 dat in het respectieve experiment wordt gebruikt. In (A) wordt een grafiek getoond van een controle-experiment met behulp van het PROM reporter-gen zonder TA-toevoeging. Transcripties gelabeld met MS2-GFP geven continue transcriptionele activiteit aan gedurende de gehele observatieperiode. De grafiek in (B) vertegenwoordigt het PROM reporter-gen bij TA-toevoeging en inductie van een DSB, wat leidt tot een onderdrukking van transcriptie voor de resterende observatietijd. De EX2 reporter gengrafiek in (C) toont een transcriptieonderdrukking van canonieke promotor-gedreven transcriptie bij TA-additie. Later in dezelfde time-lapse komt alleen de PP7-RFP gelabelde transcriptionele activiteit naar voren. In de grafiek in (D) wordt de EX2-AS reporter-gentranscriptie van de canonieke promotor in zinsrichting op dezelfde manier onderdrukt bij TA-toevoeging aan het EX2 reporter-gen in (C). Het verschijnen van MS2-RFP-gelabelde transcripten afkomstig van de inverse ingevoegde MS2-stamlussequentie duidt echter op antisense-transcriptie die afwezig is tijdens zintuigtranscriptieactiviteit vóór TA-toevoeging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Reporter cellijn EX2 en EX2-AS PROM Plasmiden om te transfecteren 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP 0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry 0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP 0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP Tabel 1: Transfectie van de reporter gen cellijnen. De tabel beschrijft de transfectieschema’s en hoeveelheden van de verschillende plasmiden die worden gebruikt om de verschillende reporter-gencellijnen tijdelijk te transfecteren.

Discussion

Conflicten tussen essentiële biologische processen zoals replicatie, transcriptie, DNA-schade en DNA-reparatie zijn geïdentificeerd als een kritieke bron van genoominstabiliteit22. Deze studies hebben ook geleid tot de ontdekking van transcriptie op plaatsen van DNA-schade en hebben een functionele rol toegeschreven aan de door breuk geïnduceerde transcripten bij het reguleren van DNA-schadeherstelprocessen23. De nieuwe tools en het protocol dat hier wordt beschreven, maken verder onderzoek mogelijk naar de transcriptie van RNA Pol II bij DSB’s. Een kritiek punt in dit protocol is het genereren van cellijnen die een enkele kopie van het reporter-gen bevatten dat in het genoom is geïntegreerd. Deze belangrijke functie elimineert de ruis die wordt gecreëerd door de transcriptie van verschillende reportergenen geïntegreerd met meerdere kopieën binnen een enkele genomische locus en maakt het verzamelen van kinetische parameters van transcriptiedynamica en individuele RNA-transcripten mogelijk. Een cruciale technische vereiste om transcriptie van single reporter genintegraties te observeren, is de beschikbaarheid van een microscoopsysteem dat de detectie mogelijk maakt van enkele RNA-transcripten gelabeld met het MS2- of PP7-systeem in levende cellen4,12. Hier wordt live-cell microscopie uitgevoerd op een Confocal Spinning Disk-systeem gemonteerd op een omgekeerde microscoop, uitgerust met 100 mW solid-state lasers gekoppeld aan een akoestisch-optisch afstembaar filter zoals elders beschreven24. Bovendien, om transcriptie op een enkele DSB te bestuderen met behulp van de reporters, moeten individuele cellen zorgvuldig worden gecontroleerd om de hoogste tijdresolutie te bereiken, waarvoor beeldvormingscellen enkele uren nodig zijn, waardoor dit een test met lage doorvoer is. Toch observeren we verschillende cellen parallel aan de positionering die wordt geregeld door een piëzo-aangedreven microscooptrap. Om optimale omgevingsomstandigheden te garanderen voor observatie van levende cellen gedurende uren, wordt het microscooplichaam, inclusief de monsterfase, in een plexiglas omgevingskamer geplaatst. Bovendien is een gesloten fase incubatiekamer gemonteerd op de microscooptrap en aangesloten op CO2– en vochtigheidstoevoerregelaars.

De eerste cruciale stap in het protocol is de selectie van gebieden die van belang zijn met cellen voor beeldvorming. Elke XY-positie die voor beeldvorming is gemarkeerd, moet een of meer cellen bevatten die transfectie vertonen met de fluorescerende RNA-stamlusbindende eiwitten volgens het reportergen en transfectieschema beschreven in sectie 1, tabel 1, evenals in figuur 2D, E. Bovendien moeten de cellen helder gelabelde transcriptieplaatsen vertonen die samen met het I-SceI-GR-iRFP713-construct moeten worden getransfecteerd en moet het eiwit in eerste instantie in het cytoplasma worden gelokaliseerd (figuur 2D en E).

De cellen moeten een fluorescentie-intensiteitsniveau vertonen van ongebonden fluorescerend gelabeld MS2- en /of PP7-coatingeiwit dat laag genoeg is om enkele gelabelde transcripten over het achtergrondfluorescentieniveau te detecteren. Tegelijkertijd is een robuust fluorescentie-intensiteitsniveau van de fluorescerend gelabelde MS2- en / of PP7-coatingeiwitten nodig om beeldvorming gedurende ten minste 60 minuten mogelijk te maken zonder al te veel fluorescentie te verliezen als gevolg van wat bleken dat optreedt. De “Schaalbeeldweergave” met een vast bereik zoals beschreven in paragraaf 3.7 wordt gebruikt om een gestandaardiseerde selectie van cellen mogelijk te maken op basis van hun fluorescentie-intensiteitsniveau.

Een tweede kritieke protocolstap is het toevoegen van de TA aan de cellen op vooraf bepaalde XY-posities door het kleine gat in het deksel van de glazen bodemschaal. Elke manipulatie van de glazen bodemschaal zou een verschuiving van de gemarkeerde XY-positie van de cellen veroorzaken en moet worden vermeden. Daarom is het zorgvuldig hanteren van de micropipette tijdens het toevoegen van de TA verdund in het cellulaire groeimedium van vitaal belang voor de succesvolle observatie van vooraf geselecteerde cellen, zoals aangetoond in figuur 2F. De aanpassing van verschillende systemen om geneesmiddelen toe te voegen aan cellen die op een microscooptrap zijn gemonteerd, zoals een perfusiesysteem, zou een aparte fase-incubatiekamer vereisen met buisingang en uitgangen en een pomp- of injectiesysteem om geneesmiddelen toe te dienen. Andere methoden zoals kanaalglijbanen met coverslip-achtige bodemoppervlakken resulteren in een langzame diffusie van toegediende geneesmiddelen in het kanaal en veroorzaken een extra vertraging tussen toevoeging en effect van geneesmiddelen. Ten slotte kan onvoorzichtig pipetteren in een kanaalschuifopening ook de monsterpositie verschuiven. Daarom is het huidige systeem met een op maat geboord gat in het deksel van een schotel met glazen bodem eenvoudig aan te passen, goedkoop en geschikt voor het toedienen van verschillende groeimedia, medicijnen en componenten. De kleine diameter van het gat en de bevochtigde atmosfeer in de podiumincubatiekamer voorkomt ook uitdroging van het celmedium.

Een derde cruciale stap in dit protocol is de data-analyse, die een handmatige inspectie vereist van de tijdspunten waarop transcriptie stopt als gevolg van de inductie van een DSB. Het tijdstip van beëindiging van transcriptie wordt aangegeven door de laatste transcripties vrij te geven van de eerder heldere gelabelde site van de transcriptie van het reporter-gen. Evenzo moeten de gebeurtenissen van break-geïnduceerde transcriptie-initiatie met zorg worden geïnspecteerd om individuele transcriptiegebeurtenissen te detecteren met de relatief lage signaal-ruisverhouding van enkele fluorescerend gelabelde mRNA’s.

De dynamiek van reparatie van de geïnduceerde DSB voegt een extra laag complexiteit toe aan de analyses van gegevens die met behulp van deze verslaggevers worden gegenereerd, waardoor ze worden beperkt tot de eerste minuten onmiddellijk na inductie van de DSB. De transgene aard van reportergenen en de herhalingsrijke aard van de MS2- en PP7-stamlusarrays kunnen een uniek chromatinelandschap samenstellen, waardoor vermoedelijk stabiele break-geïnduceerde transcriptieprogramma’s worden verstoord. Niettemin, in vergelijking met ioniserende of UV-bestraling, is de I-SceI gemedieerde inductie van een DSB in reportergenen een veel robuuster systeem om transcriptie bij individuele DB’s te onderzoeken.

Verschillende endonucleasesystemen zoals I-CreI, I-PpoI of AsiSI die al dan niet extra herkenningsplaatsen in het menselijk genoom hebben, kunnen worden gecombineerd met de huidige reporter-gensystemen voor een mogelijk hogere efficiëntie van het genereren van DSB’s. Ze vereisen echter eerst de endonucleaseherkenningsplaats in de reportergenen. Ten tweede kunnen ze een vergelijkbare variabiliteit hebben op de timing en efficiëntie-inductie van een DSB in individuele cellen. Aan de andere kant kan het invoegen van tandemkopieën van endonucleaseherkenningsplaatsen de efficiëntie van DSB-inductie verhogen. Bovendien zou het testen van de gepresenteerde reporter-gensystemen in verschillende cellijnen de vergelijking van transcriptiedynamiek op DSB-locaties tussen verschillende cellulaire achtergronden en de beschikbaarheid van verschillende DNA-schadeherstelroutes zoals in kankercellen, primaire cellen en gedifferentieerde niet-fietsende cellen mogelijk maken. De constructie van de reportergenen om compatibel te zijn met het Flp/FRT-systeem beperkt momenteel echter de integratie in beschikbare Flp/FRT-gastheercellijnen.

Naast op microscopie gebaseerde toepassingen kunnen de huidige reportergenen ook worden gecombineerd met biochemische assays, zoals chromatine-immunoprecipitatie, om de rekrutering van DNA-reparatie- of transcriptiefactoren voor een enkele DSB te bestuderen of om de bezetting van nucleosoom, histonmodificaties en chromatinetoestand rond de DSB-site te beoordelen. Bovendien zou een combinatie met verschillende reportersystemen de studie van functionele verbanden tussen DNA-schade en processen zoals genoomorganisatie of DNA-replicatie mogelijk maken.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca voor geschenken van plasmiden en reagentia. We zijn ook dank verschuldigd aan de medewerkers van de iMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento en J. Rino, voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 en PTDC/MED-OUT/4301/2020 van Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal en door LISBOA-01-0145-FEDER-007391, project medegefinancierd door FEDER via POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa en FCT. Er is ook financiering ontvangen uit het EU-programma voor onderzoek en innovatie Horizon 2020 (RiboMed 857119). MA is de ontvanger van de FCT Ph.D. fellowship 2020.05899.BD.

Materials

100 mW solid-state Lasers Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system Intelligent Imaging Innovations Inc.
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 Photometrics, Tucson, AZ USA
Axio Observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss MicroImaging, Germany
Blasticidin InvivoGen ant-bl-1
charcoal-stripped fetal bovine serum Sigma-Aldrich F6765-500 ML
CO2 module S PeCon GmbH, Erbach, Germany
CSU-X1 confocal spinning disk unit Yokogawa Electric, Tokyo, Japan
DMEM Gibco 41966029
DMEM with Hepes no PhenolRed Gibco 21063-029
Doxicyclin Sigma-Aldrich D9891 for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium
FBS Gibco 10270106
Flp-In T-REx 293 cell line Thermo Fischer Scientific Invitrogen R75007
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence GeneArt, Thermo Fischer Scientific custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences
Heating Device Humidity 2000 PeCon GmbH, Erbach, Germany
Hygromycin B Roche 10843555001
Immersion oil Immersol 518 F Carl Zeiss MicroImaging Inc.) 444960-0000-000
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 Thermo Fisher Scientific L3000001 transfection helper reagent
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 lipid-based transfection reagent
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 MatTek Corporation, Ashland, MA, USA P35G-1.5-10-C
microscope incubation chamber PeCon GmbH, Erbach, Germany
pcDNA5/FRT/TO Thermo Fischer Scientific Invitrogen V652020
pOG44 plasmid Thermo Fischer Scientific Invitrogen V600520
SlideBook 6.0 Software Intelligent Imaging Innovations Inc.
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 PeCon GmbH, Erbach, Germany
StaQtool Software iMM-JLA Lisbon, Portugal available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip
triamcinolone acetonide (TA) Sigma-Aldrich T6501 synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus
Trypsin/EDTA Solution (TE) Thermo Fisher Scientific R001100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d’Adda di Fagagna, F. Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin. FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).
  3. Michelini, F., et al. Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks. Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).
  4. Vítor, A. C., et al. Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin. Science Advances. 5 (1), (2019).
  5. Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. Small RNA response at DNA ends in Drosophila. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).
  6. Wei, W., et al. A role for small RNAs in DNA double-strand break repair. Cell. 149 (1), 101-112 (2012).
  7. Francia, S., et al. Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response. Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).
  8. Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24 (2020).
  9. Alt, F. W., et al. Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3′ ends. Cell. 20 (2), 293-301 (1980).
  10. Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. The role of exon sequences in splice site selection. Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).
  11. Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65). Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).
  12. Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity. Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).
  13. Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
  14. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  15. Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).
  16. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  17. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  18. Soutoglou, E., et al. Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).
  19. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096 (1994).
  20. Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. Science. 341 (6146), 660 (2013).
  21. Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells. Methods. 98, 143-149 (2016).
  22. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  23. D’Alessandro, G., d’Adda di Fagagna, F. Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords. Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).
  24. Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).

Tags

Keywords: Live-cell ImagingTranscriptional ActivityDNA Double-strand BreaksTranscription DetectionSingle-cell AnalysisDNA Damage ResponseTranscription-replication CrosstalkDoxycycline InductionCalibration MeasurementsMicrocentrifuge Tube PreparationTransfectionGlass Bottom DishMicroscopy Observation
check_url/pt/62968?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
de Almeida, M. R., Gameiro, E., de Almeida, S. F., Martin, R. M. Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks. J. Vis. Exp. (175), e62968, doi:10.3791/62968 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image