DNA双链断裂时转录活性的活细胞成像

1. 用于活细胞显微镜的细胞制备和转染 在活细胞显微镜 实验前一天，准备一个25 cm2细胞培养瓶，报告细胞系（EX2，EX2-AS或PROM）与5mL DMEM一起达到80-90%的汇合度。 用移液管从25 cm 2 细胞培养瓶中吸出培养基，并用2.5mL 1x PBS洗涤细胞。 加入1mL胰蛋白酶-EDTA（0.05%），并在37°C下孵育2-3分钟以进行细胞脱离。 细胞脱离后，加入4mL不含酚红的DMEM含HEPES缓冲液，补充10%（v / v）木炭剥离的胎牛血清，并轻轻重悬细胞。 将细胞溶液的板1mL放入具有10 mm玻璃底孔（直径1.5号）的35mm圆形培养皿中并均质化。将35mm圆形培养皿储存在100mm标准细胞培养皿中，并将其在37°C下在具有5%CO 2的加湿气氛中孵育。 接种后〜6小时，转染玻璃底培养皿中的细胞。对于每种转染混合物，按以下方式制备两种溶液： 在1.5mL微量离心管中，制备含有150μL还原血清最小必需培养基（MEM），质粒DNA（如 表1所述）和2.5μg/ μL转染辅助试剂DNA的溶液A（见 材料表）。 同时，制备溶液B，含有150μL还原血清MEM和1.5μg/ μL脂质转染试剂的DNA（见 材料表）。 将两种溶液在室温（RT）下孵育5分钟。然后，将溶液A轻轻加入溶液B中，并在室温下孵育20分钟。 要转染细胞，将300μL溶液A + B滴加到每个培养皿中并轻轻分布。将玻璃底培养皿储存在100毫米标准细胞培养皿中，并将其在37°C的加湿气氛中孵育，其中CO2含量为5%。 准备一个1.5mL微量离心管，其中200μLDMEM与HEPES，没有酚红，补充10%（v / v）木炭剥离的胎牛血清，并加入TA至7.5×10-7 M的浓度。 2. 实验设置 在公共控制单元处将大型有机玻璃显微镜孵育室和顶台孵育室的温度设置为37°C。将舞台培养箱内的环境条件设置为5%CO2 和100%湿度。注：在开始实验之前，必须至少设置显微镜笼和载物台培养箱的温度，以允许加热整个系统，以尽量减少温度波动。同时启动所有其他显微镜控制和操作单元。 通过向生长培养基中加入多西环素（0.5μg/ mL）来诱导报告基因的转录，并在开始显微镜观察之前用200μL微量移液器上下移液约1小时轻轻混合。注意：将转染细胞的玻璃底培养皿保持在100毫米标准细胞培养皿内，以便于处理，并在聚苯乙烯泡沫塑料容器中从细胞培养物运输到显微镜室，以保持温度尽可能稳定。 在开始观察之前至少30分钟将细胞运送到显微镜中，并在到达后，将100mm培养皿与细胞立即放在预热的大型显微镜孵育室内。 将微量离心管与步骤1.7中预稀释的TA放在一起。在大型显微镜环境室内加热至37°C。 更换玻璃底盘的盖子，类似于之前准备的盖子，在盖子上钻一个直径为3毫米的孔（图2A）。注意：TA稍后将通过盖子上的小孔添加到细胞中，而无需操纵安装在显微镜载物台上的培养皿。 在显微镜控制面板中选择100x（复消色差物镜，1.4数值孔径）油浸物镜。在物镜上涂抹一滴浸入油。 将玻璃底培养皿与细胞放在显微镜台式孵育室内，并将其锁定到位。合上载物台培养箱的盖子和显微镜外壳的所有门。 启动显微镜操作和控制软件，打开 焦点控制 窗口（图2B），单击 示波器 窗格，然后在发射 选择 窗格中，单击 100%眼 框以设置眼光束路径，以便用眼睛直接观察样品。 在 “滤镜集 “菜单中，切换到 “眼睛 “滤镜集并单击” 明场”，然后按 “打开明场 “按钮。 将显微镜物镜朝向玻璃底盘移动，直到油接触到玻璃。然后通过目镜观察并手动聚焦在细胞的平面上。关闭” 打开明场 “按钮。 在开始实验观察之前，将细胞放置30分钟，以适应环境条件，并通过温度梯度防止成像过程中的焦点漂移。 将200 μL微量移液管和200 μL滤嘴尖端放在室温下备用。 3. 图像采集 在显微镜 控制 软件的对焦控制窗口中，将激光强度设置为5%，并输入曝光时间值50 ms（图2B）。 打开 “捕获 “窗口以调整设置以执行三维（3D）延时的自动图像采集（图2C）。 选择 3D捕获 采集类型并设置12到16个相隔0.4μm的光学切片，勾选 “电流范围” 和 “捕获后返回当前位置”复选框。 在” 延时捕捉 “窗格中，输入值 120 表示 时间点数 ，输入 30 秒作为 间隔。 根据转染的荧光蛋白标记选择共聚焦滤光片集 ，GFP 为 λ = 488 nm，TagRFPt 为 λ = 561 nm， iRFP713 为 λ = 640 nm ，并将每个通道的曝光时间设置为 50 ms。 使用激光功率的 电流 设置，使用在 对焦窗口中 选择的5%值（图2C）。 在” 对焦控制 “窗口中，转到” 相机 “窗格，选择” 缩放图像显示 “控件，然后选择” 手动 “按钮以设置要显示的固定图像强度范围。输入 “低：500″和”高：5000” 的值（请参见 图 2B）。注：此设置限制了实时取景中显示的相机捕获的动态范围，以选择相同荧光强度范围内的细胞（图2D）。 选择用于诱导DSB时转录位点的3D延时成像的细胞。筛选单元格并根据讨论中描述的条件选择三个视场。 将先前位于视野中心的每个选定细胞聚焦，转录位点位于Z-stack的中间平面。注意：将细胞和转录位点居中置于XYZ中，以适应细胞的某些运动。 通过单击”设置点”，在”焦点控制”窗口的”XY”窗格中标记每个 XYZ 位置。注意：在接下来的5分钟内重新访问所选位置2-3次，以确认报告基因的连续转录和XYZ维度中细胞位置的相对位置稳定性。 从步骤1.7中加入200μL预稀释的TA。如图 2F所示的单元格。注意：在添加 TA 时，请格外小心，不要触摸玻璃底碟或盖子，以防止从标记的 XY 位置发生任何偏移。DSB诱导后，确认细胞在视野内居中，转录位点在中心Z平面。重新对焦和位置更新不应超过1-2分钟。 通过单击”捕获”窗口中的”开始”来启动 3D 时间序列成像。 将成像数据保存在显微镜控制软件中，数据格式在显微镜控制计算机硬盘上。 4. 数据分析 在显微镜控制软件中打开成像数据，并导出为16位TIFF格式的文件。 使用StaQtool21 软件打开导出的文件。选择 单点3D 模式，然后按 Go加载图像文件。注：所选时间序列将在 “最大投影延时摄影器”中打开，显示第一个时间点的 z-stack 的最大强度投影（图 3A）。 使用左侧的垂直 MAX 滑块调整图像强度显示。 使用水平”时间点”滑块选择要分析 的时间点 。 将光标悬停在标记的转录站点的位置以进行手动标记，或使用 自动检测 功能，如果检测到多个对象，则按相应的转录站点。 使用 自动跟踪 功能可以确定转录站点随时间变化的 XYZ 位置。注意：如果未正确跟踪给定位置，请根据 StaQtool 软件手册手动选择转录站点。 按 “自动 “按钮为每个时间点执行高斯拟合，并测量总荧光强度 （TFI）。注意：如果转录活性停止，跟踪工具将保持在检测到衍射受限物体（标记的转录位点）的最后一个位置。如果细胞在转录位点标签消失后沿XY方向移动，则需要手动重新定位 搜索方块 。 完成每个时间点的 TFI 值拟合后，按 结束延时 按钮关闭当前时序图像文件并继续下一个文件。注意：TFI 值将自动导出并保存在 Excel 文件中。 5. 显微镜校准测量和分析 将细胞接种到35mm玻璃底培养皿中，并用荧光标记的MS2和PP7涂层蛋白转染，如第1节所述。注意：对于校准测量，请使用简介中描述的相同报告基因细胞系。 在开始显微镜图像采集之前，向细胞的生长培养基中加入0.5μg/ mL多西环素1小时。 将玻璃底皿安装在显微镜载物台孵育室内，并像以前一样准备图像采集（见第2节）。注：校准实验时，玻璃底盘的原始盖子不会更换。 使用与第 3.1 点中所述的相同激光强度和曝光设置。 设置 2D 时间序列的 “捕捉 “设置（在” 捕捉类型 “窗格中取消选择 3D 选项），并在” 延时捕捉” 面板中以 500 毫秒的间隔设置 120 个时间点（图 2C）。注：此图像采集设置将导致单个光学平面内的时间序列以非常短的间隔。 从多个位置获取数十个校准时间序列，以生成数据集以计算数百个单份成绩单TFI测量值。 对于校准时间序列的分析，请根据点 4.1 将文件转换为 16 位 TIFF 格式的文件。 使用StaQtool21 软件打开导出的文件（图3）。按 选择日志文件 按钮，选择按点4.2中所述获取的相应2D时间序列的日志文件。 选中 多点 2D 复选框，然后按 GO 按钮将时间序列加载到分析软件中。 在 延时摄影查看器窗口 （图3A）中，在PSF FWHM中，输入字段插入为显微镜系统和物镜计算的值，如所述21。 要开始分析过程，请按 “自动检测 “按钮以检测显示的当前时间点的所有衍射受限物体。然后，单击 AutoFit 以执行高斯拟合以确定每个对象的 TFI 值（图 3A）。 或者，将光标指向衍射受限的对象，然后单击以选择它（白色正方形内出现绿色圆圈），然后按 “高斯拟合” 按钮进行手动选择和高斯拟合过程。注意：建议使用最后一种模式来排除未计数的对象，例如同一细胞核中存在多个新生转录本的明亮转录位点。 按 结束延时 按钮完成上一步。注意：结果将自动以 Microsoft Excel 文件格式保存在与图像文件相同的文件夹中。 通过按下相应的按钮启动多个点 的TFI和W分布 模块（图3B）。 通过”添加文件”按钮加载Excel文件，然后按”转到”按钮开始TFI分析。注：输出是从多个测量的单一转录本TFI确定的平均TFI值。 通过插入先前在点 5.10 中使用的 PSF FWHM 来开始 W 分析。，然后使用 Bin 的默认值 按 Go 按钮 。注：W参数是单转录本TFI测量的质量控制，以符合所用显微镜系统的正确PSF FWHM值。 6. 数据和校准合并 输入从第 4.8 点中保存的 Excel 工作表中获取的时间序列 TFI 值。放入新的 Excel 工作表中，并将每个时间点值除以在点 5.15 中获得的单个成绩单的平均 TFI。注意：为了标准化此过程，使用了自定义准备的 Excel 模板表单。