Denne protokollen introduserer trinn for metabarkodingsanalyse, rettet mot 16S rRNA- og 18S rRNA-gener, for overvåking av skadelige algeoppblomstringer og deres tilhørende mikrobiom i sjøvannsprøver. Det er et kraftig molekylært basert verktøy, men krever flere prosedyrer, som forklares visuelt her trinn for trinn.
Overvåking av skadelige alger (HAB) har blitt implementert over hele verden, og Chile, et land kjent for sine fiskerier og akvakultur, har intensivt brukt mikroskopiske og toksinanalyser i flere tiår for dette formålet. Molekylære biologiske metoder, som DNA-sekvensering med høy gjennomstrømning og bakterielle sammenstillingsbaserte tilnærminger, begynner bare å bli introdusert i chilensk HAB-overvåking, og prosedyrene er ennå ikke standardisert. Her innføres 16S rRNA og 18S rRNA metabarkodingsanalyser for overvåking av chilenske HAB-er trinnvis. Ifølge en nylig hypotese spiller algebakteriell gjensidig forening et kritisk synergetisk eller antagonistisk forhold som står for gjenoppblomstring, vedlikehold og regresjon. Overvåking av HAB fra algebakterielle perspektiver kan dermed gi en bredere forståelse av HAB-mekanismer og grunnlaget for tidlig varsling. Metabarkodingsanalyse er et av de best egnede molekylærbaserte verktøyene for dette formålet fordi det kan oppdage massiv algebakteriell taksonomisk informasjon i en prøve. De visuelle prosedyrene for prøvetaking til metabarkodingsanalyse heri gir spesifikke instruksjoner, med sikte på å redusere feil og innsamling av pålitelige data.
Mange marine planteplanktonarter er kjent for å produsere endogene giftstoffer, og når disse artene akkumuleres i tilstrekkelig antall, er de skadelige for det marine miljøet. Slike skadelige algeoppblomstringer (HAB) observeres i dag på kysten av de fleste kontinenter i verden1. Giftig planteplankton akkumuleres først i bivalvevev, noe som fører til sykdom og død i høyere trofiske nivåer av organismer, inkludert mennesker, ved fordøyelsen. Deretter gir disse hendelsene alvorlige konsekvenser for den lokale økonomien, sosioøkonomi og folkehelse2. Skadene på den globale økonomien forårsaket av HAB-er anslås å være millioner til milliarder av dollar hvert år3. Chile er et av mange land som lider av hyppige HAB-er.
Chile er et land med langt land som strekker seg over 4300 km nord og sør. Det langstrakte vestlige landet vender mot Stillehavet, noe som naturlig øker sjansene for at Chile opplever HAB-er. Spesielt i Sør-Chile er det mange verdensberømte lakseoppdrett, og hver gang en HAB oppstår i regionen, resulterer algetoksinene i massiv oppdrettslaks som blir syk og dør4,5,6. I Chile, året da HAB rammet økonomien hardest var 2016, med et estimert årlig tap på US $ 800 millioner7,8. De forårsakende giftige algeartene varierer etter år og sted. For 2016-saken forårsaket et kompleks av Alexandrium catanella og Pseudochattonella verruclosa en utbredt HAB i det meste av den sørlige chilenske kysten7,8. Den siste HAB i Chile skjedde med de forårsakende algeartene til Heterosigma Akashiwo i mars 2021 ved Camanchaca, som ligger sør i Chile, hvor området har en stor lakseoppdrett.
Chile har gjennomført kystovervåking i mange år ved hjelp av to hovedmetoder; observere sjøvann med mikroskoper for å identifisere giftige alger arter regelmessig og måle toksinnivåer i skalldyr ved biokjemiske analyser9. Tidlig påvisning av giftige alger og toksinnivåer i skalldyr forhindrer ikke HAB; Disse analysene kan imidlertid utløse umiddelbare mottiltak og redusere skader på lokalsamfunnene. For ytterligere å styrke effektiviteten av denne strategien ble en molekylærbasert analytisk metode nylig lagt til vårt konvensjonelle chilenske HAB-overvåkingsprogram for å oppdage alger og relaterte bakteriesamfunn i sjøvannsprøver. Nærmere bestemt ble det valgt en massiv parallell sekvenseringsmetode ved hjelp av metabarkoding som er rettet mot 16S rRNA- og 18S rRNA-gener. Selv om denne teknikken krever kompliserte prosedyrer og dyre maskiner og reagenser, er det en avansert teknologi som kan oppdage tusenvis av alger og bakterier slekter / arter som er tilstede i en sjøvannsprøve samtidig.
Årsakene til HAB spekuleres i å være forskjellige, for eksempel temperatur og sesong, men det er umulig å generalisere dem. Dette skyldes at HAB-arter og frekvenser avhenger av regionen og romlige forhold, som involverer naturfenomener som geografisk unikhet, oppstrømning av næringsblanding og elementavrenning fra land på grunn av errosion2,10,11,12. I tillegg påvirker kunstige faktorer som eutrofiering lokaleHAB-er 12,13. På grunn av den komplekse multifaktoren er det ikke lett å lage en nøyaktig HAB-prediksjon. De siste årene er det en oppfatning at spesifikke bakteriepopulasjoner kan være relatert til utviklingen av HAB som en av faktorene, og forskning for å støtte denne hypotesen har blitt stadig tydeligere14,15,16,17,18. Molekylærbiologiske teknikker brukes vanligvis til å studere bakteriell montering; En slik standardisert metode er imidlertid ennå ikke etablert i chilensk HAB-overvåking9. For å studere algebakteriell tilknytning til HAB er det viktig å samtidig utføre metabarkodingsanalyse for de nåværende chilenske kystovervåkingsprogrammene. Dermed introduserer denne protokollen visuelt vårt chilenske HAB-overvåkingsprogram, med fokus på en trinnvis prosedyre for å analysere deteksjon av alger og bakterier i sjøvannsprøver ved hjelp av metabarkodingsanalyse.
Den fullstendige protokollen som beskriver vårt chilenske HAB-overvåkingsprogram er tilgjengelig i Yarimizu et al.9. Det inkluderer prosedyrene for sjøvannsprøvetaking, mikroskopisk algeartdeteksjon, algebakteriell gendeteksjon, pigmentanalyse, meteorologisk datainnsamling og fysiske og kjemiske vannegenskapsanalyser. Den trinnvise protokollen for 16S rRNA og 18S rRNA metabarkodingsanalyse for alge- og bakteriearter er tilgjengelig som preprint19. Denne protokollen demonstrerer spesielt metabarkodingsanalysetrinn siden det er den mest kompliserte delen og høydepunktet i vårt HAB-overvåkingsprogram. Denne protokollen inkluderer også en introduksjon av programmet og mikroskopideteksjon av algearter. Ved analyse av algearter ved metabarkoding er det avgjørende å samtidig utføre mikroskopi for å verifisere resultatene fra de to metodene. Denne protokollen inkluderer ikke hvordan du bruker programvare til taksonomitilordning, men databaseanbefaling er kort angitt på slutten av delen nedenfor.
Denne protokollen utførte vellykket 18S rRNA og 16S rRNA gen metabarkodingsanalyse for å identifisere alge- og bakteriearter i sjøvannsprøver for overvåking av chilenske HAB-er. De dominerende alger og noen mindre alger oppdaget av denne protokollen var i samsvar med de som ble oppnådd ved mikroskopi, og bekreftet protokollens pålitelighet. Høydepunktet i protokollen er at analysen oppdaget Alexandrium spp. og Pseudochattonella spp., de to mest problematiske HAB forårsaker arter i Sør-Chile, fra sjøvannet i Metri selv ved lav overflod. Spesielt Pseudochattonella spp. er utfordrende arter å identifisere under et mikroskop fordi cellene er små og lett ruptured under lys eller bruk av fikseringer27,28. Metabarkoding kan gi algearter informasjon som knapt finnes i sjøvannsprøver som mikroskopi ikke kan identifisere. Protokollen oppdaget også over 30 bakteriearter. Selv om hvordan disse bakteriene er relatert til algevekst er ukjent på dette tidspunktet, vil massiv datainnsamling av algebakterielle arter i tidsserieanalysen muligens gi så viktige funn. Dermed vil det å legge til metabarkodingsanalyse til de konvensjonelle chilenske HAB-overvåkingsprogrammene utvilsomt styrke den nåværende HAB-overvåkingseffektiviteten. Faktisk kan denne visuelle protokollen for metabarkodingsanalyse være gunstig, ikke bare for chilensk vanns algebakterielle overvåking, men også for kystovervåkingsprogrammer i andre HAB-berørte områder over hele verden.
Selv om denne protokollen ga de ovennevnte fordelene, bør ulempene ved metoden diskuteres. Som det fremgår av den visuelle protokollen, er metabarkodingsmetoden tidkrevende og kompleks, og krever dyre maskiner og reagenser. Laboratoriepersonalet må være spesialutdannet, ellers vil det kaste bort materiale, arbeidskraft og tid. I tillegg må algedeteksjon ved metabarkoding kombineres med mikroskopi for å verifisere at de samme dominerende artene er identifisert fra de to ortogonale metodene29. Mikroskopi er et ikke-invasivt verktøy, for det meste å identifisere algearter, noe som betyr at det er vanskeligere å gjøre feil når algeartene har unike og tilsynelatende former. Selvfølgelig kan menneskelig feil oppstå hvis arten har svært like former som hverandre. På den annen side, siden metabarkodingsanalyse krever flere trinn, øker det naturlig feil. Det kan være en prøve blandet opp, feil reagens tillegg, eller mangler noen prosedyrer. Derfor er det viktig å sammenligne metabarkodingsresultatene med de som oppnås ved mikroskopi. Til slutt gjelder protokollen bare kvalitativt, og resultatene må beregnes for relativ overflod. Som Lamb et al. uttalte i 2019, er den nåværende metabarkodingen som kvantitativ ytelse fortsatt begrenset, og ytterligere forskning er nødvendig før metabarkoding trygt kan brukes til kvantitative applikasjoner30.
Denne protokollen ble optimalisert for 140 – 170 prøver per kjøring fra 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation manual utgitt av Illumina Inc. Den optimaliserte protokollen ble testet mange ganger og ytterligere endret for å utstede denne endelige versjonen. Derfor anbefales det sterkt å følge hvert trinn nøyaktig. Den mest kritiske delen av protokollen er at det er nødvendig med ekstra forsiktighet for å unngå prøvekontaminering. Pipettene og laminær strømningshetten må rengjøres med 70% alkohol- og UV-eksponering til enhver tid, og steriliserbare materialer skal autoklaveres. Primerne og reagensene skal fortynnes direkte fra lageret ved hver nye kjøring, eller gjenbruk av reagenser og eksponering for flere fortynninger kan være en prøveforurensningsårsak. Protokollen angir når operasjonen kan utføres utenfor laminær strømningshette. Med mindre annet er mulig, bør prøvene behandles i en rengjort laminær strømningshette. Når du arbeider med flere 8-rørs strimler samtidig, anbefales det å jobbe på den første 8-rørs stripen og hette den før du går til neste 8-rørs stripe. Å la lokket stå åpent i lang tid kan forårsake prøveforurensning, da 16S- og 18S rRNA-gener er svært allestedsnærværende i omgivelsene. Den angitte tiden, for eksempel blandingstid og inkubasjonstid, bør følges som nøyaktig beskrevet fordi den beste varigheten for hvert trinn ble valgt basert på flere testkjøringer. Overflødig eller utilstrekkelig tid kan for eksempel redusere prøveutbyttet. Prosessen bør bare stoppes på den delen protokollen sier at den kan stoppe. Det er avgjørende å ha en negativ kontroll da det bekrefter at de positive resultatene ikke er kunstige falske positiver. Til slutt anbefales det på det sterkeste å planlegge dagene fordi det krever minst fem dager å behandle alle trinnene, og noen deler kan ikke stoppes før neste stoppskilt.
Begrensningen av taksonomisk tilordning for sekvenserte data er kort notert her. Nyoppdagede nukleotidsekvenser for bakterielle og algearter oppdateres daglig i databanken. Mens godt studerte alge- og bakteriearter er registrert pålitelig, er det også mange sekvenser for ukjente arter oppdatert i databanken. Det indikerer at oppløsningen av registrerte nukleotidsekvenser ikke alltid er nok for artsidentifikasjon, men bare for slektsidentifikasjon. Dermed må mikroskopisk artidentifikasjon utføres ortogonalt. Etablering av en rørledning med åpen tilgang for dette arbeidet har en betydelig fordel i å håndtere et stort sett med sekvenserte data samtidig og effektivt undersøke når det oppstår en feil. I tillegg er utgangen av DADA2 i en tekst- eller csv-fil, noe som gjør det enkelt å videreutvikle statistisk analyse. På den annen side kreves en stor server for å utføre taksonomiske oppdrag, spesielt når et datasett er stort. For å sette opp datasamlebåndet er det nødvendig med ingeniører for å sette opp rørledningen, og fagpersonene må forstå parametere, drift, Linux og bioinformatikk.
Bortsett fra omfanget som et HAB-overvåkingsverktøy, kan bruken av denne protokollen utvides til undersøkende forskningsformål. For eksempel er det pågående debatter mellom den chilenske regjeringen og lokale fiskere sammen med miljøfredsforeninger om det økte antallet lokale HAB31,32. Regjeringen hevder at det skyldes et naturfenomen som global oppvarming og El Niño, mens de senere partiene hevder at lakseoppdrett er årsaken. Laks er ikke en urfolksart i Chile og var ikke i chilensk vann for et halvt århundre siden. Den chilenske regjeringen på den tiden hadde som mål å øke økonomien og skape arbeidsplasser for fattige områder ved å utvikle en laksevirksomhet33. Med intervensjonen fra utlandet for kapitalfortjeneste gjorde Chile stor suksess i havbruksutvikling i pennestil, og antall laks har økt bemerkelsesverdig de siste tiårene31,32,33. Deretter er en stor mengde mat til laks kastet i sjøen, noe som fører til at lokalbefolkningen mistenker at lakseoppdrett er årsaken til de hyppige lokale HAB-ene31,32. Sannheten er ukjent nå, men den må etter hvert forstås slik at strategier for å beskytte det lokale marine miljøet, økonomien og menneskers helse mot HAB-er kan utarbeides. Den molekylærbaserte analysen av det lokale algebakterielle forholdet kan bidra til en trinnvis avklaring for et slikt emne. For eksempel kan teknikken søke i alge- og bakteriearter som ikke var til stede i målområdet før, men har økt dramatisk de siste årene, noe som er noe lik studien gjort av Sakai et al. for oppdagelsen av en uinnspilt befolkning av Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) av GIS og eDNA analyse34. Derfor, utover HAB-overvåkingsverktøyet, har denne metabarkodingsprotokollen potensiell bruk for andre prospekter.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av stipendet (JPMJSA1705) for en studie om science and technology research partnership for Sustainable Development-Monitoring Algae in Chile (SATREPS-MACH). Vi takker Dr. Sandra Rios (Universidad de Los Lagos) for at vi kunne bruke et filmklipp. Vi takker Neal Andrew Holland for hans flittige korrekturlesing av manuskriptet. Vi uttrykker vår oppriktige takknemlighet til laboratoriegruppemedlemmene ved CREAN-IFOP i Puerto Montt, Chile, for å gi oss råd om planteplanktonidentifikasjon.
1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
Heat block | |||
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |