Повышение содержания опухоли с помощью макродиссекции опухоли

Ткани FFPE часто представляют собой гетерогенные примеси опухолевых и неопухолевых тканей. Высокочувствительные геномные тесты становятся все более распространенными как в клинических, так и в исследовательских условиях, но могут быть сбиты с толку наличием загрязняющей неопухолевой ткани. Действительно, минимальное содержание опухоли в 60% часто рекомендуется для геномных исследований. Процентное содержание опухоли может быть определено площадью ткани, занятой опухолевым материалом, или долей опухолевых клеток внутри ткани. Хотя опухоль по площади является широко используемой метрикой чистоты опухоли, она не всегда изображает точное описание ткани. Рассмотрим две ткани, обе с 1000 клетками, из которых 500 являются опухолевыми клетками. В ткани А 500 неопухолевых клеток представляют собой стромальные клетки с объемами, аналогичными объемам опухолевой клетки. В этой ткани процент опухоли можно считать 50% как по клеточности, так и по площади. В ткани B 500 неопухолевых клеток представляют собой жировые клетки с объемами, которые в 4 раза больше, чем опухолевые клетки. В этой ткани процент опухоли по-прежнему составляет 50% по клеточности, но 20% по площади. Третья ткань, ткань С, состоит из 500 опухолевых клеток плюс 400 жировых клеток и 800 стромальных клеток с объемами, которые в 4 и 0,5 раза больше, чем опухолевые клетки, соответственно. Учитывая, что 100 жировых клеток равны объему 800 стромальных клеток, процент опухоли ткани С составляет 29% по клеточности (500/1700), но все же 20% по площади. Ткань D также состоит из опухолевых, жировых и стромальных клеток с объемными соотношениями 1x, 4x и 0,1x. Однако количество клеток составляет 400, 10 и 720 соответственно. Таким образом, процент опухоли ткани D составляет 35% по клеточности (400/1130), но 78% по площади. Эти примеры чрезмерно упрощены и не отражают реальных тканевых композиций, но ясно передают важность состава ткани и разницу между содержанием опухоли по площади и по клеточности. Важно отметить, что когда дело доходит до обогащения содержания опухоли для последующей экстракции нуклеиновых кислот, клеточность опухоли является более важным атрибутом из-за повышенного смешивающего потенциала извлечения геномного материала из большего количества неопухолевых клеток, чем опухолевых клеток. Это не только подчеркивает необходимость оценки опухолевого содержания тканей с точки зрения процентной клеточности, но и необходимость иссечения нежелательной ткани, чтобы свести к минимуму любые потенциальные негативные последствия неопухолевой ткани. Существует несколько методов обогащения тканей, основными из которых являются макродиссекция и микродиссекция.

Макродиссекция, метод, описанный в этом протоколе, является относительно быстрым, простым и не требует дорогостоящего или специализированного оборудования. Хотя макродиссекция может значительно улучшить содержание опухоли, важно понимать, что она не полностью устраняет неопухолевой материал. Целью макродиссекции является достаточное обогащение интересующей ткани путем исключения нежелательной ткани, чтобы уменьшить «шум», исходящий от нежелательной ткани, что, в свою очередь, может усилить сигнал интереса от интересующей ткани. Таким образом, макродиссекционное опосредованное обогащение опухоли является способом повышения отношения сигнал/шум с целью лучшего обнаружения маркеров, представляющих интерес, особенно опухолеспецифических молекулярных маркеров с низким содержанием или плохой экспрессией. Тем не менее, макродиссекция имеет ограничения из-за отсутствия точности, предлагаемой грубыми инструментами, такими как лезвия бритвы, и подвержена проблемам точности, связанным с толщиной линии маркера патологоанатома, а также потенциальным ошибкам при отслеживании демаркаций H &E патологоанатомов. Как упоминалось выше, невозможно достичь 100% чистоты опухоли из-за наличия присущих и вызывающих опухоль стромальных элементов (то есть соединительной ткани, стромальных фибробластов, кровеносных сосудов, доброкачественных реактивных лимфоцитов, макрофагов), встроенных в саму опухоль. Действительно, многие инвазивные или диффузно инфильтративные злокачественные новообразования вызывают устойчивый десмопластический стромальный ответ, в результате чего образуются кластеры опухолевых клеток, которые тесно смешиваются со стромальными фибробластами и другими неопухолевыми типами клеток; где опухоли, связанные с этой картиной стромальной реакции, такие как ткани рака поджелудочной железы²¹, могут в большей степени выигрывать от микродиссекции с цифровым управлением, а не от ручной макродиссекции.

Ручная микродиссекция выполняется под микроскопом для облегчения идентификации, рассечения и выделения тканей специфических клеток или популяций с использованием иглы или скальпеля и имеет преимущество повышенной точности по сравнению с макродиссекцией²². Тем не менее, ручная микродиссекция является трудоемким процессом, которому не хватает утонченности, необходимой для сложных тканей с низким содержанием опухоли или сложными особенностями, несовместимыми с ручной рассечением. Такие ткани могут быть рассечены с использованием высокоточных автоматизированных методов, таких как микродиссекция лазерного захвата. Действительно, было показано, что микродиссекция с цифровым управлением дает более высокий процент содержимого опухоли по сравнению с ручной макродиссекцией в тканях рака поджелудочной железы²³. Однако недостатки этих высокоточных автоматизированных методов, такие как потребность в специализированном, дорогостоящем оборудовании и высококвалифицированных специалистах, препятствуют его включению в рабочие процессы. Исследование, проведенное de Bruin et al., сравнивающее влияние макродиссекции и микродиссекции лазерного захвата (LCM) на профилирование экспрессии генов, показало, что образцы LCM имели низкий общий выход РНК (30 нг в среднем) и требовали двух раундов амплификации мРНК для достижения порога входа²⁴ подготовки библиотеки кДНК. Авторы обнаружили, что результирующие профили экспрессии генов LCM были затронуты раундами амплификации мРНК больше, чем макрорассекционные профили были затронуты неопухолевыми стромальными вкладами, и пришли к выводу, что макродиссекция может быть адекватно использована для получения надежных данных экспрессии генов²⁴.

Существенным преимуществом профилирования экспрессии цифровых генов NanoString, особенно при работе с сильно деградированной РНК, полученной из FFPE, является то, что оно не требует ферментативно-зависимых процессов, таких как амплификация РНК или подготовка библиотек кДНК. Тем не менее, анализы обычно оптимизированы для входов между 50-300 нг общей РНК^25,26, которые, основываясь на выводах de Bruin et ^al.24, могут быть несовместимы с микродиссеченными тканями без увеличения тканевого входа; неблагоприятный спрос в эпоху, когда образцы тканей все чаще собираются в виде небольших биопсий, а не хирургических резекций. Входные данные РНК, используемые для анализа DLBCL90, варьировались от 68,5 до 300 нг как для макродиссеченных, так и для нерасфеченных тканей. Результаты показывают, что макродиссекция привела к изменениям вызовов в 60% исследованных образцов и что эти изменения наблюдались независимо от входа РНК макрорассектированных образцов. Тем не менее, вероятность COO для низкого входа РНК действительно посягала на порог вероятности вызова COO GCB / UNC, где пороговые значения составляют от 0 до 0,9 до 1,0 для вызовов ABC²⁰. Основными подтипами DLBCL COO являются GCB и ABC, которые составляют 41% и 44% всех случаев DLBCL, причем UNC представляет собой промежуточную группу из двух, а ABC – наиболее агрессивные ^20,27. Таким образом, в то время как изменение вызова COO при макродиссекции образца C не вызвало откровенного изменения подтипа COO с GCB на ABC, изменение от GCB к UNC может указывать на сдвиг в сторону более агрессивного заболевания. Более того, недавние исследования показывают, что подтип UNC является не просто промежуточным подтипом и что он может потенциально обладать подтип-специфическими терапевтически эксплуатируемыми атрибутами²⁸. Аналогичным образом, макродиссекция образцов A и E не вызывала откровенных изменений в вызовах DHITsig от DH отрицательного к DH положительному, или наоборот. Однако перемещения образца GCB (образец A) из NEG в UNCLASS и образца ABC (образец E) из UNCLASS в NEG при макродиссекции являются биологически приемлемыми, поскольку транслокации двойного попадания с участием BCL2, как сообщается, являются исключительно феноменом GCB¹⁹. Хотя транслокации традиционно и повсеместно обнаруживаются FISH в клинических условиях, растет импульс к выявлению альтернативного менее сложного и трудоемкого метода их обнаружения. Анализ DLBCL90 является важным инструментом, который удовлетворяет эту потребность, где обоснование его использования подкрепляется выводом о том, что этот анализ способен обнаруживать транслокации, загадочные для зондов FISH, используемых в клинической диагностике²⁹.

Протокол макродиссекции, описанный выше, описывает простой метод, который позволяет исследователям увеличить содержание опухоли в образцах тканей, которые обычно опускаются ниже обычно используемых пороговых значений критериев включения в исследование. Включение макродиссекции в рабочий процесс исследования позволяет исследователям спасать плохо плотные опухолями ткани от исключения исследования путем увеличения их опухолевого содержания. В свою очередь, это позволяет повысить уверенность в том, что полученные элюаты РНК и ДНК представляют собой опухоль, исследуемую геномом. Хотя существуют и другие более точные методы рассечения тканей, для опухолей, которые растут более экспансивным, неинфильтративным, листовидным или твердым образом, макродиссекции, вероятно, достаточно. Представленные здесь результаты подчеркивают важность чистоты опухоли в геномных анализах и макродиссекции как надежного инструмента для достижения этого.