Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti
Summary
Multipleks in situ hibridizasyon (ISH), yetişkin farenin tüm vagal gangliyonik kompleksinde iki G protein bağlantılı reseptör ve bir transkripsiyon faktörü için transkriptleri aynı anda görselleştirmek için kullanıldı. Bu protokol, vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.
Abstract
Bu çalışmada, fare juguler-nodose gangliyonunun multipleks in situ hibridizasyonu (ISH) için bir protokol açıklanmaktadır ve özellikle G protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) ekspresyonunu tespit etmeye vurgulanmaktadır. Formalin-sabit juguler-nodose gangliyonları, iki temsili GPCR’nin (kolesistokin ve ghrelin reseptörleri) ifadesini nodose (eşleştirilmiş homeobox 2b, Phox2b) veya juguler afferent nöronların (PR etki alanı çinko parmak proteini 12, Prdm12) bir işaret geni ile birlikte aynı anda tespit etmek için RNAscope teknolojisi ile işlendi. Etiketli gangliyonlar, yukarıda belirtilen transkriptlerin dağılım ve ifade kalıplarını belirlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Kısaca, Phox2b afferent nöronların kolesistokinin reseptörü (Cck1r) bolca ifade edildiği, ancak ghrelin reseptörü (Ghsr) ifade etmediği bulunmuştur. Prdm12 afferent nöronlarının küçük bir alt kümesinin de Ghsr ve/veya Cck1r’i ifade ettiği bulunmuştur. Bu makalede açıklanan yaklaşım, bilim adamlarının vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmalarına yardımcı olabilir.
Introduction
Vagal afferentlerin hücre gövdeleri juguler, petrosal ve nodose gangliyon1,2,3‘te bulunur. Aksonları vagus sinirinin birkaç dalı aracılığıyla kraniyoserikal, torasik ve abdominal bölgelere birlikte seyahat eder4,5,6,7. İçsel uçlarından, vagal afferentler çok çeşitli fizyolojik ve zararlı uyaranlara yanıt verebilir8,9,10. Bununla birlikte, vagal algılamada yer alan sinyal moleküllerinin ve reseptörlerin dağılımı kötü karakterize olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni kısmen vagal gangliyonların, küçük boyutlarına rağmen, çok sayıda GPCR 8 , 11 , 12,13dahil olmak üzere geniş bir reseptör spektrumunu ifade etmeleridir. Ayrıca, vagal afferent nöronlar doğası gereği heterojendir ve farklı moleküler profiller görüntüler14. Konuyu karmaşıklaştırmak için, juguler, petrosal ve nodose gangliyonları fareye bağlanır ve böylece tek bir gangliyonik kütle oluşturur. Son olarak, hayvanların bir alt kümesinde, nodose ganglionu sempatik üstün servikal ganglion15‘e bağlanır.
Geçmişte, araştırmacılar vagal afferent nöronların nörokimyasal makyajını incelemek için immünhistokimyaya başvurdular16,17,18. Doğrulanmış antikorların kullanılması immünostokimya yararlı olmakla birlikte, immünohistokimyasal çalışmaların sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır. Örneğin, GPCR’lere karşı spesifik antikorları tanımlamaya yönelik çok sayıda çaba başarısız oldu19,20,21 , 22,23,24,25, araştırmacıların GPCR’lere karşı antikorların çoğunluğunun güvenilmez olduğu sonucuna varmasına yol açtı. Bu sorunları atlatmak için, kemirgen vagal gangliyonik kütle26 , 27 , 28,29gen ekspresyonini değerlendirmek için nicel PCR (qPCR) yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, qPCR kullanılarak gen ekspresyonunun incelenmesi, mekansal bilgi kaybı pahasına gerçekleşir. Özellikle, kaç hücrenin veya hangi hücre tiplerinin belirli bir ilgi genini (örneğin, nodose ve juguler hücreler) ifade ettiği tahmin edilemez. Tekrarlayan sorunlar ayrıca bitişik dokularla kontaminasyon ve diseksiyon sırasında vagus sinirinin değişken uzunluklarının, üstün servikal ve juguler gangliyonların dahil edilmesini içerir15. Yukarıdaki zorlukların bir sonucu olarak, tartışmalar vagal afferent nöronlarda birkaç GPCR’nin ekspresyon ve dağılımını çevreler. Özellikle şaşırtıcı bir örnek ghrelin reseptörü (Ghsr) ile ilgilidir. Bazı çalışmalar vagal afferent nöronlarda bu reseptörün yaygın ekspresyonunun30,31,32, diğerleri Ghsr mRNA’nın nodose ganglion 11,14’teneredeyse tespit edilemediğini bulmuşlardır. Bu nedenle vagal gangliyonik kütlede Ghsr mRNA’nın ayrıntılı haritalandırılması garanti edilir.
In situ hibridizasyon (ISH) vagal gangliyonik kütle7, 11 ,12,33,34,35gen ekspresyon kalıplarını değerlendirmek için de kullanılmıştır. RNA tabanlı teknikler çoğu durumda antikor bazlı tekniklerden daha güvenilir ve spesifik kaldığından36,37, ISH çalışmaları vagal afferent nöronların nörokimyasal kodlamasının daha iyi anlaşılması için değerli olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, geleneksel ISH tekniklerinin kendileri uyarı olmadan değildir. Radyoaktif ISH hassastır, ancak arka plan oluşturur ve hantalkalır 38. Radyoaktif olmayan ISH daha az karmaşık ama aynı zamanda daha az hassas38. Buna karşılık, son zamanlarda geliştirilen RNAscope ISH yöntemi son derece hassastır ve en az arka planoluşturur 39. Mevcut çalışma, farenin vagal afferent nöronlarında GPCR’lerin tespitine multipleks floresan RNAscope uyguladı. Ghsr’nin dağılımını haritalamaya odaklandık ve dağıtımını nodose ganglion34’teifade edildiği bilinen başka bir GPCR olan kolesistokinin reseptörü (Cck1r) ile karşılaştırdık. Son olarak, eşleştirilmiş homeobox 2b (Phox2b) ve PR etki alanı çinko parmak proteini 12 (Prdm12) olmak üzere iki transkripsiyon faktörü, nodose ve juguler afferent nöronlar için seçici belirteçler olarak kullanılmıştır, sırasıyla14. Phox2b veya Prdm12’yi görselleştirmeden, jugular vs. nodose afferentlerini kesin olarak tanımlamak zor olacaktır. Makale boyunca potansiyel teknik tuzaklar da tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
ISH tekniği 1960’ların sonunda icat edildi42. Ancak, 1980’lerin ortalarına kadar merkezi ve periferik sinir sistemlerinde mRNA’ların tespiti için uygulanmadı43,44. Sinir sisteminin heterojenliği ve antikorlarla ilgili tekrarlayan sorunlar göz önüne alındığında, belirli bir transkriptin hücresel düzeyde lokalize edilmesi paha biçilmez bir araç olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, geleneksel ISH yöntemleri zahmetli v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH grant #5P01DK119130-02 tarafından finanse edilen Nöroanatomi/Histoloji/Beyin Enjeksiyon Çekirdeği tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, kısmen NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi tarafından desteklenen Harold C. Simmons Kanser Merkezi’nin Ortak Kaynağı olan NIH Grant #1S10OD021684-01 tarafından desteklenen UT Southwestern Canlı Hücre Görüntüleme Tesisi (Dr. Phelps başkanlığındaki) ve personelinin (Abhijit Bugde ve Marcel Mettlen) yardımını kabul etmek istiyor. P30 CA142543.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
Referências
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O’Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neurociência. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D’Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
