זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום
Summary
מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) הועסק כדי לדמיין בו זמנית את התמלילים עבור שני קולטנים מצמידי חלבון G וגורם שעתוק אחד בכל הקומפלקס הגנגליוני של העכבר הבוגר. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים vagal afferent.
Abstract
מחקר זה מתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) של הגרעינים וריד הצוואר-לולאה העכבר, עם דגש מיוחד על זיהוי הביטוי של קולטנים חלבון G (GPCRs). גרעיני וריד הצוואר-לולאה קבועים בפורמלין עובדו עם טכנולוגיית RNAscope כדי לזהות בו זמנית את הביטוי של שני GPCRs מייצגים (קולטני cholecystokinin ו ghrelin) בשילוב עם גן סמן אחד של או לולאה (תיבת הומיאוbox דמוית זיווג 2b, Phox2b) או נוירונים מושבעים ורידיים (חלבון אצבע אבץ יחסי ציבור 12, Prdm12). גרעינים מסומנים צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבוע את דפוסי ההפצה והביטוי של התעתיקים הנ”ל. בקצרה, נוירונים afferent Phox2b נמצאו לבטא בשפע את קולטן cholecystokinin (Cck1r) אבל לא את קולטן גרלין (Ghsr). תת-קבוצה קטנה של נוירונים afferent Prdm12 נמצא גם להביע Ghsr ו / או Cck1r. אזהרות טכניות פוטנציאליות בעיצוב, עיבוד, ופרשנות של מולטיפלקס ISH נדונים. הגישה המתוארת במאמר זה עשויה לסייע למדענים ביצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים זרים vagal.
Introduction
גופי התאים של זרים vagal כלולים בגרעפי הצוואר, פטרוסאל ונודים1,2,3. האקסונים שלהם נוסעים יחד דרך כמה ענפים של עצב הוואגוס לשטחים קרניוקרוויים, בית החזה והבטן4,5,6,7. מן סופם הקרבי, afferents vagal יכול להגיב למגוון רחב של גירויים פיזיולוגיים ומזיקים8,9,10. עם זאת, ההתפלגות של מולקולות איתות וקולטנים המעורבים חישת vagal נשאר מאופיין בצורה גרועה. הסיבה לכך היא שגרעי הוואגל, למרות גודלם הקטן, מבטאים קשת רחבה של קולטנים, כולל מספר גדול של GPCRs8,11,12,13. יתר על כן, נוירונים afferent vagal הם הטרוגניים מטבעם ולהציג פרופילים מולקולריים ברורים14. כדי לסבך את העניין, הגרעינים הצוואריים, הפטרוסאליים והנודים מחוברים לעכבר, ובכך יוצרים מסה גנגליונית אחת. לבסוף, בתת קבוצה של בעלי חיים, גנגליון הנודים מחובר לגנגליון צוואר הרחם העליון האוהד15.
בעבר, חוקרים פנו אימונוהיסטוכימיה ללמוד את האיפור הנוירוכימי של נוירונים afferent vagal16,17,18. בעוד אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים מאומתים היא שימושית, התוצאות של מחקרים אימונוהיסטוכימיים חייבים להתפרש בזהירות. לדוגמה, מאמצים רבים לזהות נוגדנים ספציפיים נגד GPCRs נכשלו19,20,21,22,23,24,25, מוביל חוקרים למסקנה כי רוב הנוגדנים נגד GPCRs אינם אמינים. כדי לעקוף בעיות אלה, PCR כמותי (qPCR) שימש נרחב להערכת ביטוי גנים במסה גנגל גנגליוני מכרסם26,27,28,29. עם זאת, בחינת ביטוי גנים באמצעות qPCR מתרחשת במחיר של אובדן מידע מרחבי. בפרט, לא ניתן לחזות כמה תאים או אילו סוגי תאים מבטאים גן מסוים של עניין (למשל, לולאה לעומת תאי הצוואר). בעיות חוזרות ונשנות כוללות גם את הזיהום עם רקמות סמוכות ואת הכללת אורכים משתנים של עצב vagus, גרעיני צוואר הרחם מעולה, וגרעיני הצוואר במהלך ניתוח15. כתוצאה מהקשיים הנ”ל, המחלוקת מקיפה את הביטוי וההפצה של מספר GPCRs בנוירונים זרים vagal. דוגמה תמוהה במיוחד מתייחסת לקולטן הגרלין (Ghsr). בעוד כמה מחקרים מצאו ביטוי נרחב של קולטן זה נוירונים afferent vagal30,31,32, אחרים מצאו Ghsr mRNA להיות כמעט בלתי ניתן לגילוי בגנגליון הנודים11,14. מיפוי מפורט של Ghsr mRNA במסה גנגליוני הוא אפוא מוצדק.
בהכלאה במקום (ISH) שימש גם להערכת דפוסי ביטוי גנים במסה הגנגלית הוואגליונית7,11,12,33,34,35. מכיוון שטכניקות מבוססות RNA נשארות אמינות וספציפיות יותר מאשר טכניקות מבוססות נוגדנים ברובהנסיבות 36,37, מחקרי ISH הוכיחו ערך להבנה טובה יותר של הקידוד הנוירוכימי של נוירונים עבים. עם זאת, טכניקות ISH המסורתיות עצמן אינן נטולות אזהרות. ISH רדיואקטיבי הוא רגיש אבל מייצר רקע ונשאר מסורבל38. ISH לא רדיואקטיבי הוא פחות מסובך אבל גם פחות רגיש38. לעומת זאת, שיטת RNAscope ISH שפותחה לאחרונה רגישה מאוד ומייצרת רקע מינימלי39. המחקר הנוכחי יישם מולטיפלקס פלואורסצנטי RNAscope לגילוי של GPCRs נוירונים afferent vagal של העכבר. התמקדנו במיפוי ההתפלגות של Ghsr והשווינו את תפוצתו לזו של קולטן cholecystokinin (Cck1r), GPCR אחר ידוע לבוא לידי ביטוי גנגליון הנודים34. לבסוף, שני גורמי שעתוק, הומיאובוקס 2b (Phox2b) וחלבון אצבע אבץ 12 (Prdm12), שימשו כסמנים סלקטיביים לנוירונים נודים ורידים, בהתאמה14. מבלי לדמיין Phox2b או Prdm12, זה יהיה מאתגר לזהות וריד לעומת נודים afferents בוודאות. מלכודות טכניות פוטנציאליות נדונות גם לאורך המאמר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקה של ISH הומצאה בסוף שנות ה -6042. עם זאת, זה לא עד אמצע שנות השמונים כי זה הוחל על גילוי mRNAs במערכות העצבים המרכזיות והיקפות43,44. בהתחשב בהטרוגניות של מערכת העצבים ובעיות חוזרות ונשנות בנוגדנים, לוקליזציה של תעתיק מסוים ברמה התאית נותרה כלי שלא…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נוירואנטומיה / היסתולוגיה / הליבה הזרקת המוח במימון מענק NIH #5P01DK119130-02. המחברים רוצים להכיר בסיוע של UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (בראשות ד”ר פלפס) וצוותו (אבהיג’יט באגדה ומרסל מאטלן), הנתמכים בחלקם על ידי מענק NIH #1S10OD021684-01, משאב משותף של מרכז הסרטן הרולד סי סימונס, הנתמך בחלקו על ידי מענק תמיכה במרכז הסרטן של NCI, P30 CA142543.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
Referências
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O’Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neurociência. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D’Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
