DUCT: Fundición de doble resina seguida de tomografía microcomputarizada para análisis hepático 3D

El protocolo descrito en este estudio fue aprobado y sigue las reglas y regulaciones de bienestar animal de la Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Junta de Ética de Investigación Animal de Estocolmo). Los animales utilizados en este estudio fueron ratones mutantes Jag1H268Q de tipo salvaje u homocigotos en un fondo mixto de C3H / N y C57bl6J. Tanto hombres como mujeres fueron incluidos en el estudio. Los animales fueron utilizados en el día postnatal 15 o como adultos entre 3 y 8 meses. 1. Inyecciones dobles de resina PreparaciónPrepare la solución de resina. Para inyecciones de resina de doble sistema, prepare resinas amarillas y verdes como se describe en los pasos 1.1.2-1.1.4. Preparar 1 ml de alícuotas de resina diluida por ratón. Resina amarilla: Diluir el caucho de silicona amarilla (alta radiopacidad) con el diluyente transparente en una dilución 3: 1 para preparar resina amarilla para inyección. Resina verde: Mezcle el caucho de silicona azul (radiopacidad indetectable) con el diluyente transparente en una dilución 1: 1 para preparar resina azul. Para generar resina verde, mezcle la resina azul diluida con la resina amarilla diluida en una proporción de 1: 1. Vórtice la resina verde a fondo hasta que el color sea homogéneo.NOTA: La resina azul tiene una radiopacidad muy baja que no es detectable con microCT, lo que por lo tanto requiere dilución con resina amarilla para crear dos resinas con diferentes radiopaciudades.PRECAUCIÓN: La resina puede contener cromato de plomo, que es un carcinógeno. Produce gases venenosos en un incendio. Manipular con cuidado y desechar la resina como residuo peligroso. Prepare dos juegos de inyección (juego de inyección #1 y set de inyección #2) con tubos como se describe en los pasos 1.1.6-1.1.11.NOTA: Para ratones adultos (>P30 (día postnatal 30) = P30 – 2 años), use el juego de inyección # 1 (tubo PE10 con 0.6 mm de diámetro exterior) para la inyección del conducto biliar común y el conjunto de inyección # 2 (tubo PE50 con 0.96 mm de diámetro exterior) para la inyección de vena porta. Para ratones postnatales jóvenes (hasta P30), prepare dos juegos de inyección # 1, uno para el conducto biliar y otro para la inyección de la vena porta (sin juego de inyección # 2 ya que la vena porta es demasiado estrecha para acomodar el tubo PE50). Para preparar el juego de inyección # 1, corte 30 cm de tubo de PE10 y estire un extremo del tubo a mano tirando de él hasta que se vuelva lo más delgado posible (Figura 1A, B, aproximadamente 0.15 mm de diámetro, el tubo de PE10 no estirado tiene un diámetro de 0.6 mm). Corte la punta del tubo de PE10 estirado en diagonal para crear una punta biselada (Figura 1B). Conecte el extremo no estirado del tubo de PE10 a una aguja de 30 G (Figura 1A, Conjunto de inyección #1). Para preparar el juego de inyección # 2, corte 30 cm de tubo de PE50 y estire un extremo del tubo a mano tirando de él hasta que se vuelva lo suficientemente delgado como para caber en la vena porta (Figura 1A, B, aproximadamente 0.7 mm, el tubo de PE50 no estirado tiene un diámetro de 0.96 mm). Corte la punta del tubo PE50 estirado en diagonal para crear una punta biselada (Figura 1B). Conecte el extremo no estirado del tubo DE PE50 a una aguja de 23 G (Figura 1A, conjunto de inyección #2).NOTA: Cada juego de inyección solo se puede usar para una inyección, ya que la resina se endurecerá en la jeringa y el tubo. Ajuste el tamaño de la punta estirada y biselada en función del tamaño del conducto biliar común y la vena porta del ratón, dependiendo de su edad, genotipo y fenotipo. Cuando no esté seguro del tamaño y el ajuste del tubo, inserte el tubo en el conducto o recipiente apropiado después de la incisión y antes de que el tubo se llene con resina. Si el tubo es demasiado ancho para caber en el conducto/ recipiente, estírelo aún más. Anestesiar al animal por inhalación de isoflurano (primer 4% en la cámara de inducción y ~ 2% usando el cono de la nariz). Coloque el ratón en un banco ventilado sobre una almohadilla de disección mientras el ratón respira isoflurano a través del cono de la nariz. Verifique que el animal esté inconsciente por un método recomendado por el instituto / IRB, por ejemplo, pellizcando una de las patas.PRECAUCIÓN: El isoflurano puede causar somnolencia o mareos al inhalar y puede causar daño al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central a través de una exposición prolongada o repetida. No lo inhale. Manipule la sustancia en un banco ventilado y en áreas bien ventiladas.NOTA: Es posible utilizar otro método anestesiante, siempre y cuando sea compatible con la perfusión cardíaca. Una vez que el animal esté inconsciente, rocíe el lado ventral con etanol al 70% para evitar la interferencia de la piel. Usando tijeras para la piel, corte la piel, la fascia y la capa muscular comenzando en la línea media de la cavidad abdominal y corte hasta la cavidad torácica para exponer los órganos internos. Agarre el proceso xifoide con fórceps para levantar el esternón y corte el diafragma y la caja torácica en ambos lados para exponer el corazón y los pulmones. Retire la caja torácica cortando las costillas en los lados izquierdo y derecho de la caja torácica con tijeras. Tenga especial cuidado de no dañar el hígado, ya que esto resultará en una fuga de la resina. Usando fórceps rectos, tire del corazón hacia el hígado y corte la aurícula derecha. Inserte una aguja de mariposa (23 G), conectada a una bomba de perfusión peristáltica, en el ventrículo izquierdo. Perfundir el ratón transcárdicamente con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y heparina (1 U/g de peso corporal del ratón). Perfuse durante 3 min con una tasa de perfusión de 5 mL/min.NOTA: Si el ratón está siendo perfundido correctamente, los órganos internos se volverán pálidos, especialmente el hígado. Si, en cambio, los pulmones se están volviendo blancos, la aguja se inserta en el ventrículo derecho y debe reposicionarse. Después de la perfusión, el ratón se exanguina y se puede eliminar del cono de la nariz y el isoflurano. Apague la bomba de isoflurano. Inyección de resina – Fundición de resina del sistema biliarMueva el ratón al microscopio de disección, el abdomen hacia arriba, la cola hacia el experimentador y aléjese del experimentador. Los hitos anatómicos de interés se representan en la Figura 2A. Localice la vena cava inferior (Figura 2A) moviendo el intestino hacia un lado. Use tijeras de resorte para hacer una pequeña incisión transversal en la vena cava inferior para permitir la liberación de la presión vascular hepática (Figura 2Bi). Exponga el conducto biliar común y la vena porta como se describe en los pasos 1.2.4-1.2.6. Mueva el intestino y el páncreas hacia el lado derecho (del experimentador) usando un hisopo de algodón humedecido con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Voltee el lado ventral del hígado hacia el corazón usando el hisopo de algodón humedecido por PBS para exponer la superficie visceral y la región hiliar. Localice el conducto biliar común que va desde la región hiliar a través del páncreas hasta el intestino en el esfínter de Oddi (Figura 2Bii, conducto biliar común delineado con la línea punteada amarilla, puntas de flecha negras apuntan al esfínter de Oddi).NOTA: Asegúrese de que el hígado esté húmedo durante todo el procedimiento rociándolo con PBS. Limpie el tejido circundante (área ~ 5 mm) del conducto biliar común usando fórceps rectos. Coloque el hilo de sutura de seda (tamaño 4-0, 0.17 mm, 3 – 5 cm de largo) debajo del conducto biliar común (Figura 2Bii) y ate un nudo suelto alrededor del conducto biliar común (Figura 2Biii).NOTA: Elija un área para el nudo a medio camino entre la región hiliar y el esfínter de Oddi y a cierta distancia de la vena porta para que después de que la sutura se apriete alrededor del conducto biliar común, no interfiera con la inyección de la vena porta. Sostenga las tijeras de resorte planas contra el conducto biliar común para hacer una incisión oblicua en el conducto biliar común en el lugar donde el conducto biliar común ingresa al páncreas y al intestino junto al esfínter de Oddi. (Figura 2Biv), la línea punteada amarilla delinea el esfínter de la región de Oddi, enfatizada por puntas de flecha negras).NOTA: Este es un paso crucial. Hacer un corte oblicuo y no transversal, y hacer una incisión; no corte el conducto biliar. Cortar a través de todo el conducto biliar hace que la inserción del tubo sea muy difícil. Justo antes de usar, mezcle 1 ml de resina amarilla con 50 μL del agente de curado (llenando y vaciando la jeringa de 1 ml) y llene una jeringa Luer de 1 ml con la mezcla de resina y agente de curado. Conecte la jeringa llena con el tubo (conjunto #1). Presione el émbolo para llenar el tubo por completo. Asegúrese de que la mezcla de resina / agente de curado gotee desde la punta del tubo.NOTA: Evite y retire las burbujas en la jeringa y el tubo para obtener mejores resultados. Usando fórceps, enderece el área alrededor de la incisión del conducto biliar común e inserte el tubo en la abertura del conducto biliar común (Figura 2Bv), con el borde más largo de la punta biselada hacia abajo hacia el lado dorsal del conducto biliar. Esta orientación asegura que la resina pueda salir de la abertura del tubo, que está orientada hacia arriba, hacia el conducto (Figura 2Bv). Apriete el nudo del hilo de seda para asegurar el tubo dentro del conducto biliar común (Figura 2Bvi). Inyecte la resina en el conducto biliar común. Observe la vesícula biliar y los lóbulos hepáticos individuales. Masajee el hígado con un hisopo de algodón humedecido con PBS para ayudar a distribuir la resina por igual. Las ramas terminales de los conductos biliares llenos de resina (en ratones de tipo salvaje) son débilmente visibles en la superficie del hígado.NOTA: El tiempo esperado para llenar el hígado es de 30 -100 s. Deje de inyectar la resina cuando aparezcan puntos de resina en la superficie del hígado (Figura 2Ci, puntas de flecha azules) o cuando se encuentre resistencia.NOTA: Trabaje lo más rápido posible ya que la resina comienza a endurecerse después de agregar el agente de curado de resina. El tiempo de trabajo desde la adición del agente de curado es de aproximadamente 15 min. Retire el tubo sacándolo del conducto biliar común y apriete rápidamente el nudo de seda con fórceps para evitar que la resina se filtre. Corte los extremos sueltos de la sutura de seda, para que no interfieran con la inyección de la vena porta. Deseche el tubo que contiene resina y la resina restante en los residuos peligrosos y la aguja en los residuos punzantes. Inyección de resina – Fundición de resina de vena porta Limpie la vena porta (área ~ 5 mm) de su tejido circundante a unos 2 cm de su entrada al hígado usando fórceps rectos. Coloque el hilo de sutura de seda (tamaño 4-0, 0.17 mm, 3 – 5 cm de largo) debajo del área despejada de la vena porta (Figura 2Ci) y ate un nudo suelto por encima (Figura 2Cii). Hacer una incisión longitudinal en la vena porta distal al hígado y al nudo (Figura 2Ciii). Mezcle 1 ml de resina verde con 50 μL del agente de curado (llenando y vaciando una jeringa de 1 ml) y llene la jeringa Luer de 1 ml con la mezcla de agente de curado de resina. Conecte la jeringa llena con el tubo (conjunto # 2 para ratones >P30, nuevo conjunto # 1 para ratones <P30). Presione el émbolo para llenar el tubo por completo. Asegúrese de que la resina gotee desde la punta del tubo.NOTA: Evite y retire las burbujas en la jeringa y el tubo para obtener mejores resultados. Usando fórceps, enderece la vena porta tirando del tejido circundante hacia el experimentador e inserte el tubo con el borde más largo de la punta biselada hacia el lado dorsal del vaso (Figura 2Ciii). Apriete el hilo de seda para asegurar el tubo en la vena porta. Inyecte la resina en la vena porta. Observe cómo los vasos sanguíneos se llenan de resina. Masajee el hígado con un hisopo de algodón humedecido con PBS para ayudar a distribuir la resina por igual (Figura 2Civ). Deje de inyectar la resina cuando todos los vasos sanguíneos estén llenos (los extremos de las venas porta son visibles en la periferia del hígado) o cuando se encuentre resistencia.NOTA: Trabaje rápido ya que la resina comienza a endurecerse después de la adición del agente de curado. El tiempo de trabajo desde la adición del agente de curado es de aproximadamente 15 minutos para el conjunto de inyección # 1 y 25 minutos para el conjunto de inyección # 2. Retire el tubo sacando el tubo de la vena porta y apriete rápidamente el nudo de seda con fórceps para evitar que la resina se filtre. Deseche el tubo que contiene resina y la resina restante en los residuos peligrosos y la aguja en los residuos punzantes. Disección y fijación hepáticaDiseccionar todo el hígado cortándolo del tejido circundante y del diafragma. Coloque suavemente todo el hígado en un tubo cónico vacío de 50 ml con el lado ventral hacia arriba y el lado dorsal apoyado en la pared del tubo cónico para evitar la deformación del hígado. Guarde el tubo cónico horizontalmente durante la noche a 4 °C para que la resina se endurezca por completo.NOTA: Cualquier recipiente que sea lo suficientemente grande como para caber en el hígado se puede utilizar en lugar de 50 ml de tubo cónico. El uso de un recipiente de fondo plano aumentará la probabilidad de que el hígado no se deforme. Separe el hígado en lóbulos individuales. Haga una selección de los lóbulos que se utilizarán para el análisis de microCT (1.4.4-1.4.5) o el control de calidad (1.4.6-1.4.8). Opcionalmente, use todo el hígado tanto para el aclaramiento óptico como para la microTC sin separarlo en lóbulos individuales.NOTA: La arquitectura hepática de los sistemas biliar y vascular es diferente en cada lóbulo y, por lo tanto, se requieren análisis de lóbulos emparejados. El despeje óptico no interfiere con el escaneo microCT, y los lóbulos utilizados para el control de calidad se pueden escanear posteriormente con microCT. Por el contrario, las muestras escaneadas con microCT se pueden borrar ópticamente posteriormente para su comparación. Por lo tanto, todo el análisis hepático es posible. En ratones de tipo salvaje (fondo genético C3H / C57bl6), el lóbulo medial derecho se llena primero mediante inyecciones de resina, lo que lo convierte en un lóbulo adecuado para el análisis de microCT, con la mayor reproducibilidad. El lóbulo lateral izquierdo es el lóbulo más grande, en el que, por lo tanto, es fácil preseleccionar la calidad de la inyección. La selección del lóbulo (o hígado entero) utilizado para el control de calidad y la exploración microCT depende del modelo animal y la pregunta de investigación. En una campana ventilada, prepare una solución de formaldehído al 4% (10 -20 ml por tubo). Fijar los lóbulos utilizados para microCT con formaldehído al 4% durante la noche a 4 °C y luego lavar una vez con PBS (10 -20 ml por tubo). Recoger los residuos de formaldehído en un contenedor separado. Mantenga los lóbulos hepáticos en PBS a 4 °C para almacenamiento a corto plazo o etanol al 70% para almacenamiento a largo plazo. Continúe con la sección 2: Tomografía microcomputarizada.PRECAUCIÓN: El formaldehído causa toxicidad aguda si se ingiere, inhala o está en contacto con la piel. El formaldehído es un líquido y vapor inflamable. Causa quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Puede causar una reacción alérgica en la piel. Fatal si se inhala (concentrado o en polvo). Puede causar irritación respiratoria. Sospechoso de causar defectos genéticos. Puede causar cáncer. Causa daño a los órganos (ojos, sistema nervioso central). Declaraciones de precaución: manténgase alejado del calor, las superficies calientes, las chispas, las llamas abiertas y otras fuentes de ignición. Prohibido fumar. Use guantes protectores y ropa protectora. En caso de derrame, quítese inmediatamente toda la ropa que esté contaminada. Si está en contacto con la piel: enjuague el área contaminada con agua. Si se inhala: retire a la persona al aire fresco y controle la respiración si se siente cómodo. Llame inmediatamente a un centro de envenenamiento / médico. Si está en los ojos: enjuague los ojos con agua durante varios minutos. Si está presente y es posible, quítese las lentes de contacto. Para el control de calidad, fije los lóbulos restantes (al menos uno) con metanol al 50% (mezclado con agua desionizada) durante un mínimo de 4 h, balanceándose a temperatura ambiente, seguido de un balanceo nocturno de metanol al 100% a temperatura ambiente. Recoger los residuos de metanol en un contenedor separado.PRECAUCIÓN: El metanol causa toxicidad aguda si se ingiere, inhala o está en contacto con la piel. El metanol es un líquido inflamable y vapor. Use guantes y ropa protectores. Evite respirar cuando manipule y manténgase alejado del fuego y el calor. Lave bien la piel después de usar. En caso de derrame, quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuague la piel con agua. Si se inhala: Retire a la persona al aire fresco y manténgase cómodo para respirar. Si se inhala, se ingiere o se expone, llame a un centro de toxicología / médico. En una campana ventilada, prepare alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml por lóbulo) solución. Coloque el lóbulo hepático en un tubo de polipropileno de 15 o 50 ml (dependiendo del tamaño del lóbulo) que contenga solución de BABB. Déjelo mecer a temperatura ambiente hasta que quede transparente. Este paso puede tardar entre 2-16 h dependiendo del tamaño del lóbulo.NOTA: La solución de BABB disuelve ciertos tipos de plástico. Es seguro almacenar las muestras en tubos de polipropileno o recipientes de vidrio.PRECAUCIÓN: El benzoato de bencilo puede causar toxicidad aguda cuando se ingiere. Es tóxico para la vida acuática con efectos duraderos. Declaraciones de precaución: lavar bien la piel después de la manipulación. Es perjudicial cuando se ingiere, en contacto con la piel o se inhala. Evite respirar humos/vapores. Lávese bien las manos después de manipularlas. No coma, beba ni fume cuando use este producto. Si se ingiere, llame a un centro de toxicología/médico si no se encuentra Bien, use en áreas ventiladas. Recoger derrames. Deseche el contenido/contenedor en una planta de eliminación de residuos aprobada. Inspeccione la calidad de la inyección. Solo el hígado bien inyectado debe escanearse con microCT. 2. Tomografía microcomputarizada Preparación de muestras Prepare el gel de agarosa al 1% mezclando 100 ml de agua destilada y 1 g de polvo de agarosa. Coloque la mezcla en un microondas y hierva la solución hasta que el polvo de agarosa se disuelva. Templar el gel de agarosa al 1% a ~ 40 ° C para evitar daños térmicos en la muestra de hígado. Coloque el lóbulo (s) de interés en un tubo cónico de 15 ml y llénelo con el gel de agarosa al 1% hasta aproximadamente 2/3 del volumen total del tubo. Este paso minimiza el movimiento no deseado de la muestra durante la medición por TC. Medición por TCNOTA: Los siguientes pasos dependen del dispositivo ct, y la configuración y las acciones específicas pueden diferir para diferentes dispositivos y fabricantes de CT. En este protocolo, el escáner de tomografía microcomputarizado utilizado estaba equipado con un tubo de rayos X de nanofoco (180 kV/15 W) y una pantalla plana dinámica de 41|100 (4048 px x 4048 px, tamaño de píxel 100 mm con binning 2) para las mediciones de TC. Monte el tubo cónico de 15 ml con la muestra en la etapa de rotación de un dispositivo de TC y permita que se adapte térmicamente a la cámara de medición durante al menos 1 h. Cuando la muestra esté adaptada térmicamente, céntrela en el campo de visión (FOV). Optimice las distancias fuente-muestra y muestra-detector (SSD, SDD) para alcanzar una resolución de vóxel suficiente, por ejemplo, 12 μm para una muestra de hígado murino adulto o 6,5 μm para hígado <P30, correspondiente a las dimensiones del FOV (para hardware especificado de antemano) 24,3 mm × 24,3 mm y 13,2 mm × 13,2 mm respectivamente. Establezca los parámetros de adquisición (es decir, aceleración de voltaje y corriente, exposición, agrupación, promedio) siguiendo las recomendaciones del fabricante del dispositivo ct para alcanzar un nivel suficiente de señal detectada. Estos parámetros no solo dependen del dispositivo de TC, sino que también dependen de la muestra y deben optimizarse para cada muestra. En Hankeova et al.9, los ajustes fueron: tensión de aceleración de 80 kV, corriente de aceleración de 160 μA, tiempo de exposición de 400 ms y 2000 imágenes. Inicie una medición por TC. Utilice un software de reconstrucción tomográfica dedicado para reconstruir los datos de la TC. 3. Análisis y segmentación de datos NOTA: Los siguientes pasos dependen del software de procesamiento de imágenes; la configuración y las acciones específicas pueden diferir según el software utilizado. Cargar los datos de CT: Seleccione Archivo > Importar > comando. Una selección adicional depende del formato específico de los datos de TC que se procesarán. Utilice la función Determinación de superficie en el panel superior para segmentar la resina en los datos mediante umbrales globales. En la ventana de diálogo, determine el valor umbral con la evaluación del histograma estableciendo la posición de la línea roja “Isovalue” para segmentar solo los recipientes llenos de resina (es decir, abarcados por la línea amarilla en el “Panel de vista previa” presentado) (Figura 3A). En el panel izquierdo, seleccione el módulo Crear ROI a partir de volumen/CAD/Malla para crear una región de interés (ROI) de los recipientes llenos de resina. En la ventana de diálogo, utilice la opción Crear ROI(s) desde Solid, seleccione el nombre del volumen procesado y confirme. Elimine la segmentación errónea de los clústeres de ruido en la región de fondo de este ROI. Marque este ROI en el panel derecho, haga clic derecho en él y seleccione el módulo Dividir ROI. En la ventana de diálogo, establezca el parámetro Volumen mínimo [vóxel] para excluir todas las partículas de ruido (este valor depende del experimento) y de los datos y debe optimizarse para cada muestra que se va a analizar (Figura 3B). Cree máscaras de canal lisas, continuas y sólidas sin artefactos en el ROI fundido con resina, por ejemplo, presencia de burbujas de aire o fugas de resina. En el panel izquierdo, use el módulo Suavizado, establezca el parámetro Resistencia de suavizado en 1 o 2 (dependiendo de los datos individuales, cuando los valores más altos podrían conducir a la deformación del modelo, especialmente cuando se trata de estructuras finas). Si es necesario, ejecute este proceso dos veces (Figura 3C). Identifique y separe los sistemas tubulares individuales en la máscara de resina segmentada. Cree un ROI separado para el sistema lleno de la resina más absorbente (la resina amarilla utilizada para la inyección del conducto biliar común) con valores de intensidad más altos en los datos de tc. Siga el procedimiento descrito en el paso 3.2. (Figura 3Di). Marque el nuevo ROI y el ROI de la máscara de resina, haga clic con el botón derecho y seleccione Restar ROI(S) y reste el nuevo ROI del ROI de la máscara de resina para crear un nuevo ROI para el sistema tubular restante (Figura 3Dii, iii). Exporte los ROI resultantes para ambos sistemas tubulares en varios formatos, según las preferencias del operador, para su posterior procesamiento en diferentes softwares. Además, procese los ROI resultantes en un software de gráficos de volumen para exportar la visualización final en forma de imagen o video.