JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Селективная очистка диких нематод caenorhabditis для обогащения бактерий кишечного микробиома

Published: August 13, 2021
doi:
10.3791/62937
, , ,
1Department of Biology,San Diego State University, 2Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure

Summary

Дикие нематоды Caenorhabditis связаны со многими микробами, часто в просвете кишечника или заражая кишечник. Этот протокол подробно описывает метод обогащения некультивируемых микробов, колонизирующих кишечник, используя сопротивление кутикулы дауэра.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) оказался отличной моделью для изучения взаимодействия хозяина и микробиома, особенно в контексте кишечника. Недавно экологический отбор проб диких нематод Caenorhabditis обнаружил разнообразный спектр ассоциированных микробов, включая бактерии, вирусы, грибы и микроспоридии. Многие из этих микробов имеют интересные фенотипы колонизации или инфекции, которые требуют дальнейшего изучения, но они часто не поддаются культивированию. Этот протокол представляет собой способ обогащения желаемых кишечных микробов у C. elegans и родственных нематод и уменьшения присутствия многих загрязняющих микробов, придерживающихся кутикулы. Этот протокол включает в себя принуждение животных к стадии развития дауэра и использование серии антибиотиков и моющих средств для удаления внешних загрязнений. Поскольку животные дауэра имеют физиологические изменения, которые защищают нематод от суровых условий окружающей среды, любые кишечные микробы будут защищены от этих условий. Но для того, чтобы обогащение работало, микроб, представляющий интерес, должен поддерживаться, когда животные превращаются в дауэров. Когда животные покидают стадию дауэра, они поодиночке размножаются в отдельные линии. Затем популяции F1 отбираются для желаемых микробов или фенотипов инфекции и против видимого загрязнения. Эти методы позволят исследователям обогатить некультурируемые микробы в просвете кишечника, которые составляют часть естественного микробиома C. elegans и внутриклеточных кишечных патогенов. Эти микробы затем могут быть изучены для колонизации или фенотипов инфекции и их влияния на приспособленность хозяина.

Introduction

Генетический модельный организм C. elegans является отличной системой in vivo для изучения взаимодействий хозяина и микроба1,2. Они имеют относительно простую физиологию по сравнению с другими животными, но большая часть их клеточной биологии принципиально похожа на млекопитающих, что делает их хорошей моделью для биологических исследований1,3,4. Кроме того, они микроскопичны, просты в обслуживании и остаются прозрачными на протяжении всей своей короткой жизни. Эти свойства позволяют быстро изучать механизмы, управляющие взаимодействием хозяина и микроба, и визуализацию инфекции in vivo и колонизацию генетически податливых хозяев5,6. Наконец, C. elegans быстро реагирует на бактериальные, грибковые и вирусные инфекции, что делает их отличной моделью для изучения взаимодействия хозяина и микробиома кишечника7,8,9.

Увеличение выборки диких C. elegans и других нематод позволило провести исследования в области экологии свободноживущих нематод и естественной генетической изменчивости10,11. В то же время отбор проб также увеличил обнаружение естественных биологических патогенов и микробов, которые взаимодействуют с C. elegans12,13,14,15, что привело к созданию многих модельных систем микробов-хозяев, которые изучают взаимодействие с вирусами, бактериями, микроспоридиями, оомицетами или грибами16,17,18,19,20 . Как правило, дикие C. elegans встречаются в гниющих стеблях и плодах, часто в более умеренном климате, и в основном они самовоспроизводятся21. Когда эти образцы приносятся в лабораторию, дикие нематоды выделяются в клональные популяции, несущие массив ассоциированной микробиоты. При обнаружении новых микробов, представляющих интерес для нематод Caenorhabditis, животные часто проходят прямой скрининг на инфекцию или колонизацию с помощью микроскопии с использованием легко визуализируемых фенотипов. Например, вирусная инфекция может быть визуализирована как распад кишечных структур, а микроспоридиальные стадии могут быть замечены внутри клеток-хозяев в виде спор или меронтов14,22. Когда микроб, представляющий интерес, обнаруживается для будущих исследований, он должен быть отделен от других загрязняющих микробов, обнаруженных в диких нематодах, чтобы его можно было изучать изолированно. Во многих случаях интересующий микроб не может быть культивирован in vitro, что делает его необходимым для обогащения микроба в нематоде-хозяине.

Например, этот протокол описывает дикий изолят C. tropicalis , содержащий бактерию, которая колонизируется в просвете кишечника нематод, прилипая к эпителиальным клеткам кишечника направленным образом. Фенотипически бактерия растет перпендикулярно вдоль внутренних сторон просвета кишечника, придавая ему щетиноподобный вид, визуализируемый на стандартном микроскопе Нормарского на всех стадиях животного, включая стадию Дауэра. Пластина среды роста нематоды (NGM), на которой был выращен этот дикий штамм C. tropicalis , содержала видимое загрязнение другими микробами. Этот протокол был разработан для уменьшения дополнительного загрязняющего микробного роста на пластинах для изучения этой неизвестной прилипшей бактерии. Нематоды были вытеснены в стадию дауэра, чтобы защитить бактерии в просвете, а затем очищены с помощью серии стирок. После этого неизвестные виды бактерий были идентифицированы путем рассечения кишечника и ПЦР-амплификации рибосомной ДНК 16S для секвенирования.

В целом, этот протокол может потенциально обогатить любой интересующий микроб, связанный с пойманной в дикой природе нематодой. После этого исследователи идентифицируют целевой микроб, визуализируют инфекцию in vivo или фенотипы колонизации с помощью микроскопии и изучают влияние на приспособленность хозяина или другие аспекты взаимодействия хозяина и микроба. Выделение и исследование новых микробных видов, которые взаимодействуют с нематодами Caenorhabditis , может раскрыть генетические механизмы иммунитета хозяина и новые парадигмы взаимодействия хозяин-микроб, имеющие отношение к микробному патогенезу и исследованиям микробиома.

Protocol

1. Индуцирование образования дауэра у диких нематод на плитах NGM Выращивайте дикий штамм Caenorhabditis на стандартных пластинах NGM с OP50-1 E. coli в качестве источника пищи после получения червей с некультурным микробом, представляющим интерес. Инкубируйте нематод при 20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная температура для выращивания нематод Caenorhabditis составляет 15-25 ° C, но должна быть определена эмпирически, чтобы предотвратить потерю интересующего микроба. Голодайте по тарелке животных при 20 °C в течение 4-5 дней, пока не будет израсходован весь OP50-1 и большинство из них не достигнет стадии дауэра.ПРИМЕЧАНИЕ: Дауэры – это долгоживущие личинки, которые развиваются из-за отсутствия питания и имеют защитную кутикулу. 2. Мытье нематод Добавьте 5 мл минимальной солевой среды M9 (42 мМ Na2HPO4, 22 мМ KH2PO4, 8,6 мМ NaCl, 19 мМ NH4Cl) к 6-сантиметровой пластине голодающих червей. Используя стерильную стеклянную пипетку и колбу, пипетка поднимает M9 и червей с пластины и переносит их в стерильную 15-литровую центрифужную трубку. Используя клиническую центрифугу, вращайте червей в трубке при 1000 х г в течение 30 с при комнатной температуре. Используя стерильную пипетку 15 мл, удалите и выбросьте супернатант M9 над гранулами червей. Не беспокойте живых червей на дне трубки, оставляя примерно 50 мкл M9 над червями. Добавьте 10 мл M9 + 0,05% Triton X-100 в ту же трубку центрифуги и достаточно затяните крышку трубки. Инкубируйте трубку на нутриторе в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы удалить внешние микробы. Извлеките трубку из нутатора и открутите червей при 1000 х г в течение 30 с. Используя стерильную пипетку, удалите и выбросьте супернатант M9 над гранулами червей. Не беспокойте живых червей на дне трубки, оставляя примерно 50 мкл M9 над червями. Выполните и повторите шаги 2.5-2.8 еще три раза. 3. Дезинфекция нематод Готовят антибиотик и раствор SDS в 10 мл буфера M9, добавляя 0,25% SDS (250 мкл 10% SDS), 50 мкг/мл карбенициллина, 25 мкг/мл канамицина, 12,5 мкг/мл тетрациклина, 100 мкг/мл гентамицина, 50 мкг/мл стрептомицина, 37,5 мкг/мл хлорамфеникола и 200 мкг/мл цефотаксима (см. Таблицу материалов). Инкубируют трубку, содержащую нематоды в растворе антибиотика и SDS на нутриторе при комнатной температуре в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: Все черви и эмбрионы, не относящиеся к дауэру, умрут, но многие из червей дауэра переживут этот процесс очистки. 4. Удаление антибиотика и раствора SDS Вращайте червей в трубке при 1000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре. Используя стерильную пипетку, удалите супернатант из трубки центрифуги, не нарушая червей в нижней части трубки. Добавьте 10 мл M9 + 0,05% Triton X-100 и достаточно затяните крышку трубки. Инкубировать пробирку на нутаторе в течение 20 мин при комнатной температуре. Выньте трубку из нутатора и открутите червей при 1000 х г в течение 1 мин. Выполните и повторите шаги 4.2-4.3 три раза. После последней промывки оставьте червячную гранулу ненарушенной на дне в 100 мкл раствора и выбросьте оставшуюся. 5. Размножайте чистый штамм нематоды Используя стерильную стеклянную пипетку, перенесите 100 мкл супернатанта и гранулы в центр 10 см пластины NGM, засеянной OP50-1. Дайте пластине высохнуть, не нарушая жидкость в центре. Дайте дауэрам выползти из центра и через газон OP50-1 в течение 5-10 минут. Осторожно возьмите один единственный дауэр и нанесите его на 6-сантиметровую посеянную пластину NGM. В общей сложности соберите не менее 10 дауэров и обложите их отдельными 6 см пластинами NGM, засеянными OP50-1 (всего 10 пластин). Инкубируйте пластины в течение 4-5 дней при 20 °C до тех пор, пока дауэры не вырастут и следующее поколение (F1) не достигнет взрослой стадии. Визуально проверьте наличие загрязнений на всех пластинах, рассматриваемых как не-OP50-1 микробный рост. Для каждой чистой пластины проверьте распространение интересующего микроба с помощью Нормарски или флуоресцентной микроскопии, такой как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)12, в зависимости от фенотипа, представляющего интерес. 6. Диссекция кишечника и ПЦР-идентификация микробных видов Выращивайте животных при 20 °C в течение 3-4 дней, чтобы они голодали и уменьшали количество бактерий OP50-1. Добавьте 5 мл среды M9 в тарелку голодающих червей. Используя стерильную стеклянную пипетку и колбу, пипетка поднимает червей M9 + с пластины и переносит их в стерильную центрифужную трубку объемом 15 мл. Используя клиническую центрифугу, вращайте червей в трубке при 1000 х г в течение 30 с при комнатной температуре. Используя стерильную пипетку объемом 15 мл, удалите супернатант из трубки центрифуги, не нарушая живых червей в нижней части трубки. Добавьте 10 мл M9 + 0,05% Triton X-100 и инкубируйте трубку на нутриторе в течение 20 мин для удаления внешних микробов. Повторите четыре раза, чтобы промыть червей. После последней промывки, используя стерильный наконечник пипетки, удалите надосадочное вещество, не нарушая гранулу на дне в 100 мкл раствора. Используя стерильный наконечник пипетки, перенесите M9 и червей в несеянную пластину NGM и дайте пластине высохнуть, пока черви ползают в течение 20 минут, чтобы помочь удалить OP50-1 из кутикулы и кишечника. Добавьте 250 мкл M9 к высушенной пластине и используйте стеклянную пипетку для переноса M9 + червей на новую несеянную пластину NGM. Опять же, дайте этой пластине высохнуть и дайте червям ползать в течение 20 минут. Добавьте 250 мкл M9 на пластину и переложите 100 мкл M9 + червей на чистое часовое стекло. Используя две стерильные иглы шприца 26 G, обезглавить нематод, удерживая червя одной иглой и используя другую иглу, чтобы разрезать червя. После обезглавливания кишечник (гранулированный) и гонада (прозрачная) из организма естественным образом выйдут из организма. Отрежьте кусочек открытой кишки, удерживая кишечник одной иглой и разрезая ее другой.ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, убедитесь, что интересующий микроб все еще присутствует в кишечнике с помощью микроскопии Нормарского, FISH или иммуногистохимии23. Переведите одну рассеченную кишку в ПЦР-трубку объемом 0,5 мл, содержащую 10 мкл стерильной воды. Повторите в общей сложности не менее 5 пробирок ПЦР, содержащих кишечник разных животных. Заморозьте пробирки ПЦР при -80 °C в течение минимум 5 мин. Извлеките трубки ПЦР из морозильной камеры и разморозьте образцы. Пипеткой жидкость вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить бактерии от кишечника. Проводят ПЦР с использованием универсальных пар праймеров против последовательности ДНК небольшой рибосомной субъединицы бактерий, дрожжей или микроспоридий, в зависимости от предполагаемого типа микроба.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, образец протокола с использованием универсальных бактериальных праймеров 16S представлен в таблице 1. Очистите ампликон с помощью набора для очистки и концентрации ДНК на основе фильтра (см. Таблицу материалов) и выполните секвенирование Сэнгера.

Representative Results

Дикий штамм C. tropicalis (JU1848) был выделен из гнилых плодов пальмы в лесу Нураг Французской Гвианы (рисунок 1A)24. Было обнаружено, что этот штамм имеет тонкие микробы, которые колонизируют просвет кишечника направленным образом (рисунок 1B). Этот микроб был легко перенесен в штамм C. elegans N2 через кокультуру со штаммом JU1848, где он аналогичным образом колонизировал просвет кишечника. Распространение JU1848 на стандартные пластины NGM, засеянные кишечной палочкой OP50-1 в течение нескольких поколений, постоянно приводило к видимому загрязнению, наблюдаемому в виде различных темных, мукоидных колоний на газоне OP50-1 и за его пределами (рисунок 2A). Тарелку дикого JU1848 морили голодом, чтобы заставить животных погрузиться в дауэр, и чистили, как описано. Одиночных животных, переживших очистку, наносили на отдельные 6-сантиметровые пластины NGM, засеянные OP50-1, и давали расти в течение 4 дней при 20 °C. Множественные пластины потомства F1 наблюдались без видимого микробного загрязнения (рисунок 2B). Было подтверждено, что потомство F1 все еще содержит прилипшие бактерии в просвете кишечника (см. Ниже). Чистых животных JU1848 промывали и обезглавливали для выделения кусочков кишечника, как описано в протоколе (этапы 6.1-6.12). Прилипшие бактерии в просвете рассеченной кишки были проверены с помощью микроскопии Номарского (рисунок 3). Микроб в просвете JU1848 подозревался как бактерия, поэтому рассеченные кишки использовались в качестве шаблона для ПЦР с использованием универсальных бактериальных праймеров 16S, 27F и 1492R. В общей сложности из шести отдельных рассеченных кишок продукты ПЦР были секвенированы с помощью Сэнгера, а чистые хроматографы показали, что все шесть последовательностей были идентичны. Основываясь на этих последовательностях, эта бактерия была идентифицирована как новый вид в классе Альфапротеобактерии, но не могла быть классифицирована в известный отряд или род (Дополнительный файл 1). Рисунок 1: Прилипшие бактерии, колонизирующие просвет дикого C. tropicalis. (A) Полевой образец изображения гнилых плодов пальмы Euterpe sp. (семейство: Arecaceae) в лесу Нураг Французской Гвианы. (B) Номарское изображение штамма JU1848, наблюдаемое с тысячами длинных тонких бактерий, которые образуют кистевидный вид в просвете (lu) кишечника хозяина (in). Бактериальные (ba) слои, покрывающие кишечник, обозначены скобками ([). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Загрязняющий рост микробов теряется после очистки нематоды. (A) Дикий штамм JU1848 распространяет заметный рост микробов на стандартных 6 см пластинах NGM, засеянных бактериями E. coli OP50-1. (B) После очистки пластина потомства F1 от одного дауэра не показывает видимого микробного загрязнения после 4 дней инкубации при 20 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Прилипшие бактерии видны в просвете рассеченной кишки. Номарский снимок чистого животного JU1848, которое было обезглавлено так, что кишечник выплеснулся наружу. Колонизирующие бактерии (ba) обозначены скобкой ([) и видны в просвете (lu) куска кишечника (in), который находится вне тела нематоды (nb). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Реагент Концентрация Количество Грунтовка 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) 20 мМ 2.5 мкл Грунтовка 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 20 мМ 2.5 мкл Рассеченный кишечник в воде Н/Д 3 мкл 10-кратный буфер ПЦР в 10 раз 5 мкл дНТП 10 мМ 1 мкл Так-полимераза 5 ЕД/мкл 0.5 мкл Вода Н/Д 35.5 мкл Таблица 1: Образец протокола ПЦР с использованием универсальных бактериальных праймеров и рассеченного кишечника. Дополнительный файл 1: Выравнивание мышц бактериальных последовательностей 16S рДНК, полученных из ПЦР шести рассеченных кишечников JU1848. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Этот протокол описывает выделение и идентификацию микробов из диких изолированных нематод Caenorhabditis с использованием серии процедур очистки. Многочисленные микробы связаны с дикими изолированными нематодами, и некоторые из них имеют захватывающие фенотипы, которые могут быть использованы для будущих исследований взаимодействий хозяина и микробов и врожденного иммунитета. Многие культивируемые микробиомы и патогенные бактерии были выделены из диких нематод Caenorhabditis с использованием стандартных методов роста бактерий de vitro25,26. Однако не все микробы можно культивировать in vitro, и становится необходимым обогащать их дикими нематодами. Некоторые микробы имеют резистентную споровую стадию, например, микроспоридии, и высокие концентрации SDS могут быть использованы для уничтожения большинства бактерий и грибов, что позволяет специфически обогащать споры12. Этот протокол представляет собой метод обогащения некультивируемых кишечных микробов, которые не устойчивы к SDS и лечению антибиотиками.

Метод, представленный здесь, использует устойчивость к окружающей среде, наблюдаемую у животных dauer из-за физиологических изменений, таких как укрепление кутикулы, подавление накачки глотки и покрытие рта щечной пробкой27. Критическим шагом в этом протоколе является ночная инкубация с различными антибиотиками и 0,25% SDS. Этот шаг используется для уничтожения всех внешних микробов, оставляя внутренние микробы нетронутыми. В то время как было продемонстрировано, что C. elegans dauers выживают при концентрациях SDS на уровне 10% в течение 30 мин27, этот протокол использует умеренную, но и длительную инкубацию, чтобы не только убивать микробы, но и подвергать бактерии воздействию антибиотиков. Кроме того, умеренная концентрация SDS может помочь обеспечить выживание дауэров из других видов Caenorhabditis , поскольку воздействие C. tropicalis до 1% SDS в одночасье привело к гибели всех животных dauer. Если все дауэры погибают, то концентрация SDS и/или продолжительность воздействия SDS должны быть уменьшены. И наоборот, если пластины поколения F1 все еще имеют видимое загрязнение после очистки, концентрация SDS и время инкубации должны быть увеличены.

Еще одним важным шагом является изоляция одиночных животных после уборки. Этот шаг имеет решающее значение, так как не все животные чисты после SDS и лечения антибиотиками. Поэтому животных помещают в центр 10-сантиметровой пластины NGM с OP50-1 и дают радиально ползать наружу. Часто лучше всего выбирать более дистальных животных, так как длительное ползание через OP50-1, по-видимому, помогает удалить любые потенциальные выжившие микробы, прикрепленные к кутикуле. Однако это приводит к ограничению протокола, так как будет сложнее обогатить интересующий микроб, если он не присутствует в популяции на высокой частоте. Здесь прилипшие альфапротеобактерии присутствовали у 90%-95% населения; поэтому большинство чистых пластин имели бактерию микробиома. Однако, если интересующий микроб присутствует на гораздо более низкой частоте в популяции, может потребоваться скрининг гораздо большего количества пластин F1 .

Этот протокол, вероятно, может быть использован для выделения любого количества некультивируемых микробов, представляющих интерес, обнаруженных у диких нематод. Однако микроб должен находиться в ткани, защищенной кутикулой дауэра, способной выживать у животных дауэра, и иметь наблюдаемый фенотип у хозяина. Таким образом, этот метод может быть использован для обогащения других бактерий микробиома в просвете кишечника, помимо описанных здесь видов альфапротеобактерий, включая бактерии, которые не прилипают. Также протокол использовался для обогащения факультативной внутриклеточной бактерии Bordetella atropi, которая заражает нематоду Oscheius tipulae28. После обогащения было обнаружено, что B. atropi образует колонии на пластинах NGM, показывая, что микроб, представляющий интерес, может быть обнаружен как культивируемый in vitro после удаления быстро растущих загрязняющих веществ. Этот метод, вероятно, будет работать для микропроидов и вирусов, включая вирус Орсе, учитывая эту способность обогащать внутриклеточную бактерию. Тем не менее, эти микробы должны быть способны пережить переход в дауэр и из него.

Важно помнить, что, хотя этот протокол может быть выполнен в лаборатории уровня биобезопасности 1, стерильный метод должен поддерживаться повсюду для предотвращения дальнейшего микробного загрязнения. Протокол может быть изменен в соответствии с потребностями исследователя, включая типы / концентрации антибиотиков, процент SDS и / или добавление противогрибковых препаратов, таких как нистатин. Часто количество загрязняющих микробов, обнаруженных в дикой изолированной нематоде, может резко варьироваться. Здесь кажущаяся потеря роста E. coli без OP50-1 на пластинах NGM была использована в качестве считывания для чистого штамма нематоды. Но могут присутствовать некультивируемые популяции загрязняющих микробов, поэтому важно провести метод метагеномики, такой как секвенирование ампликона 16S рРНК, чтобы увидеть степень загрязнения26. Как только штамм червя очищен, его можно заморозить и сохранить для будущих исследований. В целом, этот протокол позволяет исследователям обогащать некультурируемые микробы дикими нематодами, позволяя им изучать влияние на приспособленность хозяина, характеризовать фенотипы колонизации или инфекции и использовать генетические инструменты для понимания механизмов, лежащих в основе взаимодействия хозяина и микроба.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Спасибо доктору Кристиану Брэндлу и Национальному научно-исследовательскому центру (CNRS) Nouragues Field Station.

Materials

Agarose Fisher Scientific BP1356
10% SDS Invitrogen AM9822
BD PrecisionGlide Needle – 26 G Fisher Scientific 305115
Carbenicillin Millipore-Sigma C1389-1G
Cefotaxime Millipore-Sigma C7039-500mg
Chloramphenicol Millipore-Sigma C0378-25G
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research 11-303C
DreamTaq Polymerase Fisher Scientific EP0711
Gentamycin Millipore-Sigma G1264-250mg
Kanamycin Millipore-Sigma K1876-1G
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Streptomycin Millipore-Sigma S6501-50G
Tetracyclin Millipore-Sigma T7660-5G
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Watch glasses VWR 470144-850
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15, 1313-1322 (2013).
  2. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24, 3-9 (2012).
  3. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Biologia do Desenvolvimento. 268, 448-456 (2004).
  4. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377, 383-396 (2019).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  6. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8215-8220 (2014).
  7. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 10, 1004200 (2014).
  8. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIG-I Homolog DRH-1 Mediates the Intracellular Pathogen Response upon Viral Infection. Journal of Virology. 94, 01173 (2020).
  9. Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15, 833-838 (2014).
  10. Félix, M. -. A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10, 59 (2012).
  11. Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology and Evolution. 5, 794-807 (2021).
  12. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
  13. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28, 640-648 (2018).
  14. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9, 1000586 (2011).
  15. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
  16. Félix, M. -. A., Wang, D. Natural viruses of Caenorhabditis nematodes. Annual Review Genetics. 53, 313-326 (2019).
  17. Grover, M., Barkoulas, M. C. elegans as a new tractable host to study infections by animal pathogenic oomycetes. PLoS Pathogens. 17, 1009316 (2021).
  18. Bakowski, M. A., Luallen, R. J., Troemel, E. R. Microsporidia Infections in Caenorhabditis Elegans and Other Nematodes. Microsporidia: Pathogens of Opportunity: First Edition. , (2014).
  19. Taffoni, C., Pujol, N. Mechanisms of innate immunity in C. elegans epidermis. Tissue Barriers. 3, 1078432 (2015).
  20. Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10, 3025-3039 (2020).
  21. Frézal, L., Félix, M. -. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  22. Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 2736-2752 (2008).
  23. Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Characterization of microsporidia-induced developmental arrest and a transmembrane leucine-rich repeat protein in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 10, 0124065 (2015).
  24. Félix, M. -. A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13, 10 (2013).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Androwski, R. J., Flatt, K. M., Schroeder, N. E. Phenotypic plasticity and remodeling in the stress-induced C. elegans dauer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 278 (2017).
  28. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Félix, M. -. A., Luallen, R. J. Bacterial filamentation is an in vivo mechanism for cell-to-cell spreading. bioRxiv. , (2021).

Tags

CaenorhabditisNematodesMicrobiomeEnrichmentIntestinal MicrobiomeUnculturable MicrobesOP51 Escherichia ColiDauer StageM9 Minimal Salts MediaTriton X-100AntibioticSDS Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M., Luallen, R. J. Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria. J. Vis. Exp. (174), e62937, doi:10.3791/62937 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image