장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

1. NGM 플레이트에 야생 선충을 위한 다우어 형성 유도 OP50-1 대장균을 식품 원으로 표준 NGM 플레이트에 야생 Caenorhabditis 균주를 성장시키는 것은 관심있는 미생물로 벌레를 얻은 후. 선충을 20°C에서 배양한다.참고: Caenorhabditis 선충을 성장시키는 표준 온도는 15-25°C 사이이지만 관심 있는 미생물의 손실을 방지하기 위해 경험적으로 결정되어야 합니다. 모든 OP50-1이 소비되고 대다수가 dauer 단계에 도달할 때까지 4-5 일 동안 동물의 접시를 4-5 일 동안 굶어.참고: Dauers는 영양의 부재로 인해 발전하고 보호 큐티클이 있는 장수 유충입니다. 2. 선충 세척 M9 최소 염5m(42m Na2HPO4, 22m KH2PO4, 8.6mM NaCl, 19m NH4Cl)을 6cm 의 노간 웜 플레이트에 추가합니다. 멸균 유리 파이펫과 전구를 사용하여 플레이트에서 M9과 웜을 피펫으로 올려 멸균 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 임상 원심분리기를 사용하여 실내 온도에서 30 초 동안 1000 x g 의 튜브내 웜을 회전시하십시오. 멸균 15mL 파이펫을 사용하여 웜 펠릿 위의 M9 상체를 제거하고 폐기하십시오. 벌레 위에 M9의 약 50 μL을 남겨 튜브 의 바닥에 있는 살아있는 벌레를 방해하지 마십시오. 동일한 원심분리기 튜브에 Triton X-100의 M9 + 0.05%의 M9 + 0.05%를 추가하고 튜브의 캡을 적절히 조입니다. 외부 미생물을 제거하기 위해 실온에서 20 분 동안 영양사에 튜브를 배양하십시오. 영양사에서 튜브를 제거하고 30 s에 대한 1000 x g 에서 벌레를 회전. 멸균 파이펫을 사용하여 벌레의 펠릿 위의 M9 상체를 제거하고 폐기하십시오. 벌레 위에 M9의 약 50 μL을 남겨 튜브 의 바닥에 있는 살아있는 벌레를 방해하지 마십시오. 2.5-2.8 단계를 3번 더 수행합니다. 3. 선충소 소독 0.25% SDS(10% SDS의 250 μL), 카베니실린 50 μg/mL을 추가하여 M9 완충제 10mL로 항생제 및 SDS 용액을 준비하고, 카나마이신 25μg/mL, 테트라사이클린 12.5 μg/mL, 젠타마이신 100μg/mL, 연쇄상 구균 50μg/mL, 클로람페니콜 37.5 μg/mL, 실포메메의 200μg/mL( 실체). 항생제및 SDS 용액에 선충을 함유한 튜브를 밤새 실온에서 누에이터에 배양한다.참고 : 모든 비 dauer 벌레와 배아는 죽을 것이다, 하지만 dauer 벌레의 대부분은이 청소 과정에서 살아남을 것이다. 4. 항생제 및 SDS 용액 제거 실온에서 1 분 동안 1000 x g 로 튜브의 벌레를 회전시십시오. 멸균 파이펫을 사용하여 튜브 바닥의 웜을 방해하지 않고 원심분리기 튜브에서 상퍼를 제거합니다. M9 + 0.05% 트리톤 X-100의 10mL를 추가하고 튜브의 캡을 적절히 조입니다. 실온에서 20 분 동안 영양사에 튜브를 배양하십시오. 누에이터에서 튜브를 제거하고 1 분 동안 1000 x g 에서 벌레를 회전시십시오. 4.2-4.3 단계를 세 번 수행합니다. 마지막 세척 후, 웜 펠릿을 용액의 100 μL의 바닥에 방해받지 않고 두고 나머지는 폐기하십시오. 5. 깨끗한 선충 균주를 전파 멸균 유리 파이펫을 사용하여, OP50-1로 시드된 10cm NGM 플레이트의 중앙으로 상체및 펠릿의 100 μL을 전송한다. 중앙의 액체를 방해하지 않고 접시가 건조되도록 하십시오. 다우어가 중앙에서 5-10분 동안 OP50-1 잔디를 기어 나갈 수 있도록 합니다. 조심스럽게 하나의 단일 dauer를 선택하고 6cm NGM 시드 플레이트에 접시. 총 10개의 다이어를 선택하고 OP50-1(총 10플레이트)로 시드된 개별 6cm NGM 플레이트로 플레이트를 플레이트합니다. 20°C에서 4-5일 동안 플레이트를 배양하여 다이어가 성장하고 다음 세대(F1)가 성인 단계에 도달할 때까지 배양한다. 비 OP50-1 미생물 성장으로 간주되는 모든 플레이트의 오염을 시각적으로 확인합니다. 각 클린 플레이트에 대해, 관심표현형에 따라 노마르스키 또는 형광 현미경검사법을 통한 관심있는 미생물의 전파를 확인한다(FISH)12) 6. 미생물 종의 장 해부 및 PCR 식별 3-4일 동안 20°C에서 동물을 재배하여 굶어 굶어 내고 OP50-1 박테리아의 양을 줄입니다. 굶주리고 있는 벌레 접시에 M9 용지 5mL를 추가합니다. 멸균 유리 파이펫과 전구를 사용하여 플레이트에서 M9 + 웜을 파이펫으로 올려 멸균 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 임상 원심분리기를 사용하여 실내 온도에서 30 초 동안 1000 x g 의 튜브내 웜을 회전시하십시오. 멸균 15mL 파이펫을 사용하여, 튜브 의 바닥에 살아있는 벌레를 방해하지 않고 원심 분리기 튜브에서 상체를 제거합니다. M9 + 0.05% 트리톤 X-100의 10mL를 추가하고 외부 미생물을 제거하기 위해 20 분 동안 nutator에 튜브를 배양합니다. 벌레를 씻기 위해 네 번 반복하십시오. 마지막 세척 후, 멸균 파이펫 팁을 사용하여, 용액의 100 μL에서 하단의 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. 멸균 파이펫 팁을 사용하여 M9과 웜을 시드없는 NGM 플레이트로 옮기고 벌레가 20분 동안 기어 다니는 동안 플레이트가 건조하게 하여 큐티클과 내장에서 OP50-1을 제거합니다. 말린 플레이트에 250 μL의 M9을 추가하고 유리 파이펫을 사용하여 M9 + 웜을 새로운 시드되지 않은 NGM 플레이트로 옮킵니다. 다시 말하지만, 그 접시를 건조하게하고 벌레가 20 분 동안 기어 다니도록하십시오. 플레이트에 M9 250 μL을 추가하고 M9 + 웜의 100 μL을 깨끗한 시계 유리로 옮기습니다. 멸균 26 G 주사기 바늘 2개를 사용하여 웜을 한 바늘로 잡고 다른 바늘을 사용하여 벌레를 잘라 내어 선충을 참수합니다. 참수 후, 내장 (세분화) 및 몸에서 gonad (투명) 자연스럽 게 몸에서 나올 것 이다. 하나의 바늘로 내장을 잡고 다른 바늘로 절단하여 노출 된 장의 조각을 잘라.참고: 가능하면, 관심있는 미생물이 여전히 Normarski 현미경 검사법, FISH, 또는 면역 조직 화학23을 사용하여 에버틴 장에 존재하는지 확인하십시오. 10 μL의 멸균 수를 포함하는 0.5 mL PCR 튜브로 해부된 단일 내장을 전송합니다. 다른 동물에서 내장을 포함하는 적어도 5 PCR 튜브의 총 반복. 최소 5분 동안 -80°C에서 PCR 튜브를 동결합니다. 냉동고에서 PCR 튜브를 제거하고 샘플을 해동합니다. 액체를 위아래로 몇 번 피펫하여 박테리아를 장으로부터 분리합니다. 세균의 작은 리보소말 서브유닛의 DNA 서열에 대하여 보편적 인 입문서 쌍을 사용하여 PCR을 실시, 효모, 또는 현미경 포리디아, 미생물의 의심 유형에 따라.참고: 예를 들어 범용 세균 16S 프라이머를 사용하는 샘플 프로토콜이 표 1에 제시됩니다. 필터 기반 DNA 세척 및 농도 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 앰플리코온을 정화하고 Sanger 시퀀싱을 수행합니다.