JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Selectieve reiniging van wilde caenorhabditis nematoden om te verrijken voor intestinale microbioombacteriën

Published: August 13, 2021
doi:
10.3791/62937
, , ,
1Department of Biology,San Diego State University, 2Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure

Summary

Wilde Caenorhabditis-nematoden worden geassocieerd met veel microben, vaak in het darmlumen of infecteren de darm. Dit protocol beschrijft een methode om niet-tecultureerbare microben te verrijken die de darm koloniseren, gebruikmakend van de weerstand van de dauer cuticula.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) heeft bewezen een uitstekend model te zijn voor het bestuderen van gastheer-microbe interacties en het microbioom, vooral in de context van de darmen. Onlangs heeft ecologische bemonstering van wilde Caenorhabditis-nematoden een breed scala aan geassocieerde microben ontdekt, waaronder bacteriën, virussen, schimmels en microsporidia. Veel van deze microben hebben interessante kolonisatie- of infectiefenotypen die verder onderzoek rechtvaardigen, maar ze zijn vaak niet tecultureel. Dit protocol presenteert een methode om de gewenste darmmicroben in C. elegans en verwante nematoden te verrijken en de aanwezigheid van de vele verontreinigende microben die zich aan de cuticula hechten te verminderen. Dit protocol houdt in dat dieren in het dauerstadium van ontwikkeling worden gedwongen en een reeks antibiotica- en wasmiddelwassingen worden gebruikt om externe besmetting te verwijderen. Omdat dauerdieren fysiologische veranderingen hebben die nematoden beschermen tegen barre omgevingsomstandigheden, zullen alle darmmicroben tegen deze omstandigheden worden beschermd. Maar om verrijking te laten werken, moet de microbe van belang worden gehandhaafd wanneer dieren zich ontwikkelen tot dauers. Wanneer de dieren het dauerstadium verlaten, worden ze afzonderlijk in individuele lijnen gepropageerd. F1-populaties worden vervolgens geselecteerd op gewenste microben of infectiefenotypen en tegen zichtbare besmetting. Met deze methoden kunnen onderzoekers niet-culturele microben in het darmlumen verrijken, die deel uitmaken van het natuurlijke microbioom van C. elegans en intracellulaire darmpathogenen. Deze microben kunnen vervolgens worden bestudeerd voor kolonisatie of infectiefenotypen en hun effecten op de conditie van de gastheer.

Introduction

Het genetisch modelorganisme C. elegans is een uitstekend in vivo systeem om gastheer-microbe interacties te bestuderen1,2. Ze hebben een relatief eenvoudige fysiologie in vergelijking met andere dieren, maar veel van hun celbiologie is fundamenteel vergelijkbaar met zoogdieren, waardoor ze een goed model zijn voor biologisch onderzoek1,3,4. Bovendien zijn ze microscopisch klein, gemakkelijk te onderhouden en blijven ze transparant gedurende hun korte levensduur. Deze eigenschappen maken snelle studies mogelijk naar de mechanismen die gastheer-microbe interacties regelen en visualisatie van in vivo infectie en kolonisatie van de genetisch buigzame gastheren5,6. Ten slotte reageert C. elegans snel op bacteriële, schimmel- en virale infecties, waardoor ze een uitstekend model zijn om gastheer-microbe-interacties en het darmmicrobioom te bestuderen7,8,9.

Een toename van de bemonstering van wilde C. elegans en andere nematoden heeft onderzoek naar de ecologie van vrijlevende nematoden en natuurlijke genetische variatie mogelijk gemaakt10,11. Tegelijkertijd heeft bemonstering ook de ontdekking van natuurlijk voorkomende biologische pathogenen en microben die interageren met C. elegans12,13,14,15 verhoogd, wat heeft geleid tot de oprichting van veel gastheer-microbe modelsystemen die interacties met virussen, bacteriën, microsporidia, oomyceten of schimmels bestuderen16,17,18,19,20 . Typisch, wilde C. elegans wordt gevonden in rottende stengels en vruchten, vaak in meer gematigde klimaten, en meestal zijn ze zelfproducerend21. Wanneer deze monsters in het laboratorium worden gebracht, worden wilde nematoden geïsoleerd in klonale populaties, met een reeks geassocieerde microbiota. Bij het ontdekken van nieuwe microben die van belang zijn voor Caenorhabditis-nematoden, worden dieren vaak direct gescreend op infectie of kolonisatie door microscopie met behulp van gemakkelijk te visualiseren fenotypen. Virale infectie kan bijvoorbeeld worden gevisualiseerd als een desintegratie van darmstructuren en microsporidische stadia kunnen in gastheercellen worden gezien als sporen of meronts14,22. Wanneer een microbe van belang wordt ontdekt voor toekomstig onderzoek, moet deze worden gescheiden van de andere verontreinigende microben die in de wilde nematoden worden aangetroffen, zodat deze afzonderlijk kan worden bestudeerd. In veel gevallen kan de microbe van belang niet in vitro worden gekweekt, waardoor het essentieel is om de microbe in de gastheernematode te verrijken.

Dit protocol beschrijft bijvoorbeeld een wild isolaat van C. tropicalis met een bacterie die koloniseert in het darmlumen van nematoden en zich op een directionele manier aan de darmepitheelcellen hecht. Fenotypisch groeit de bacterie loodrecht langs de binnenkant van het darmlumen, waardoor het een borstelachtig uiterlijk krijgt, gevisualiseerd op een standaard Normarski-microscoop in alle stadia van het dier, inclusief het dauerstadium. De nematodengroeimedium (NGM) plaat waarop deze wilde C. tropicalis-stam werd gekweekt, bevatte zichtbare besmetting met andere microben. Dit protocol is ontwikkeld om extra vervuilende microbiële groei op de platen te verminderen voor het bestuderen van deze onbekende aanhangende bacterie. De nematoden werden in het dauerstadium gedwongen om de bacteriën in het lumen te beschermen en vervolgens gereinigd met een reeks wasbeurten. Daarna werd de onbekende bacteriesoort geïdentificeerd door dissectie van de darmen en PCR-amplificatie van het 16S ribosomale DNA voor sequencing.

Over het algemeen kan dit protocol mogelijk elke microbe van belang verrijken die verband houdt met een in het wild gevangen nematode. Daarna zullen onderzoekers de doelmicrobe identificeren, in vivo infectie- of kolonisatiefenotypen visualiseren via microscopie en effecten bestuderen op de fitheid van de gastheer of andere aspecten van gastheer-microbe-interacties. De isolatie en het onderzoek van nieuwe microbiële soorten die interageren met Caenorhabditis-nematoden kan de genetische mechanismen van gastheerimmuniteit en nieuwe paradigma’s van gastheer-microbe-interacties blootleggen die relevant zijn voor microbiële pathogenese en microbioomstudies.

Protocol

1. Induceren van dauervorming voor wilde nematoden op NGM-platen Kweek de wilde Caenorhabditis-stam op standaard NGM-platen met OP50-1 E. coli als voedselbron na het verkrijgen van de wormen met een niet-tecultureerbare microbe van belang. Incubeer de aaltjes bij 20 °C.OPMERKING: De standaardtemperatuur om Caenorhabditis-nematoden te laten groeien ligt tussen 15-25 ° C, maar moet empirisch worden bepaald om verlies van de microbe van belang te voorkomen. Verhonger de plaat van dieren bij 20 °C gedurende 4-5 dagen totdat alle OP50-1 is geconsumeerd en de meerderheid het dauerstadium heeft bereikt.OPMERKING: Dauers zijn langlevende larven die zich ontwikkelen door de afwezigheid van voeding en beschermende nagelriemen hebben. 2. Wassen van de aaltjes Voeg 5 ml M9 minimal salts media (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) toe aan een plaat van 6 cm met uitgehongerde wormen. Pipetteer met behulp van een steriele glazen pipet en -bol de M9 en wormen van de plaat en breng ze over naar een steriele centrifugebuis van 15 ml. Draai met behulp van een klinische centrifuge de wormen in de buis bij 1000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Gebruik een steriele pipet van 15 ml en verwijder het M9-supernatant boven de pellet van wormen. Verstoor de levende wormen aan de onderkant van de buis niet door ongeveer 50 μL M9 boven de wormen te laten. Voeg 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 toe aan dezelfde centrifugebuis en draai de dop van de buis voldoende vast. Incubeer de buis op een nutator gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de externe microben te verwijderen. Verwijder de buis uit de nutator en draai de wormen op 1000 x g gedurende 30 s. Verwijder met behulp van een steriele pipet het M9-supernatant boven de pellet met wormen en gooi het weg. Verstoor de levende wormen aan de onderkant van de buis niet door ongeveer 50 μL M9 boven de wormen te laten. Volg en herhaal stap 2.5-2.8 nog drie keer. 3. Desinfecteren van de aaltjes Bereid een antibioticum en SDS-oplossing in 10 ml M9-buffer door toevoeging van 0,25% SDS (250 μL van 10% SDS), 50 μg / ml carbenicilline, 25 μg / ml kanamycine, 12,5 μg / ml tetracycline, 100 μg / ml gentamycine, 50 μg / ml streptomycine, 37,5 μg / ml chlooramfenicol en 200 μg / ml cefotaxime (zie tabel met materialen). Incubeer de buis met nematoden in het antibioticum en de SDS-oplossing op een nutator bij kamertemperatuur gedurende een nacht.OPMERKING: Alle niet-dauer wormen en embryo’s zullen sterven, maar veel van de dauerwormen zullen dit reinigingsproces overleven. 4. Het antibioticum en de SDS-oplossing verwijderen Draai de wormen in de buis bij 1000 x g gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Verwijder met behulp van een steriele pipet het supernatant uit de centrifugebuis zonder de wormen aan de onderkant van de buis te verstoren. Voeg 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 toe en draai de dop van de buis voldoende vast. Incubeer de buis op een nutator gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de buis van de nutator en draai de wormen gedurende 1 min op 1000 x g . Volg en herhaal stap 4.2-4.3 drie keer. Laat na de laatste wasbeurt de wormkorrel ongestoord op de bodem in 100 μL van de oplossing en gooi de rest weg. 5. Vermeerder een schone nematodenstam Breng met behulp van een steriele glazen pipet 100 μL van het supernatant en de pellet over naar het midden van een NGM-plaat van 10 cm gezaaid met OP50-1. Laat de plaat drogen zonder de vloeistof in het midden te verstoren. Laat de dauers 5-10 minuten uit het midden en door het OP50-1 gazon kruipen. Pak voorzichtig een enkele dauer op en leg deze op een NGM-gezaaide plaat van 6 cm. Pluk in totaal minstens 10 dauers en plaat ze in individuele 6 cm NGM-platen gezaaid met OP50-1 (10 platen in totaal). Incubeer de platen gedurende 4-5 dagen bij 20 °C totdat dauers zijn gegroeid en de volgende generatie (F1) het volwassen stadium heeft bereikt. Controleer visueel op verontreiniging op alle platen, gezien als niet-OP50-1 microbiële groei. Controleer voor elke schone plaat de voortplanting van de microbe van belang via Normarski of fluorescerende microscopie, zoals fluorescerende in situ hybridisatie (FISH)12, afhankelijk van het fenotype van belang. 6. Intestinale dissectie en PCR-identificatie van microbiële soorten Kweek dieren bij 20 °C gedurende 3-4 dagen om ze te laten verhongeren en de hoeveelheid OP50-1-bacteriën te verminderen. Voeg 5 ml M9-media toe aan de plaat met uitgehongerde wormen. Pipetteer met behulp van een steriele glazen pipet en -bol de M9 + wormen van de plaat en breng ze over naar een steriele centrifugebuis van 15 ml. Draai met behulp van een klinische centrifuge de wormen in de buis bij 1000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Gebruik een steriele pipet van 15 ml om het supernatant uit de centrifugebuis te verwijderen zonder de levende wormen aan de onderkant van de buis te verstoren. Voeg 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 toe en incubeer de buis gedurende 20 minuten op een nutator om externe microben te verwijderen. Herhaal dit vier keer om de wormen te wassen. Verwijder na de laatste wasbeurt met behulp van een steriele pipetpunt het supernatant zonder de pellet aan de onderkant te verstoren in 100 μL van de oplossing. Breng met behulp van een steriele pipetpunt M9 en de wormen over op een ongeplaatste NGM-plaat en laat de plaat drogen terwijl de wormen 20 minuten rondkruipen om OP50-1 uit de cuticula en de darm te verwijderen. Voeg 250 μL M9 toe aan de gedroogde plaat en gebruik een glazen pipet om M9 + wormen over te brengen naar een nieuwe ongeplaatste NGM-plaat. Nogmaals, laat die plaat drogen en laat de wormen 20 minuten rondkruipen. Voeg 250 μL M9 toe aan de plaat en breng 100 μL van de M9 + wormen over op een schoon horlogeglas. Onthoofd de nematoden met behulp van twee steriele 26 G-spuitnaalden door de worm met één naald naar beneden te houden en de andere naald te gebruiken om de worm te snijden. Na onthoofding komen de darm (korrelig) en de gonade (transparant) uit het lichaam vanzelf uit het lichaam. Snijd een stuk van de blootgestelde darm af door de darm met één naald vast te houden en met de andere te snijden.OPMERKING: Controleer indien mogelijk of de microbe van belang nog steeds aanwezig is in everted darmen met behulp van Normarski-microscopie, FISH of immunohistochemie23. Breng een enkele ontlede darm over in een PCR-buis van 0,5 ml met 10 μL steriel water. Herhaal dit voor een totaal van ten minste 5 PCR-buizen met darmen van verschillende dieren. Vries de PCR-buizen in bij -80 °C gedurende minimaal 5 minuten. Haal de PCR-buisjes uit de vriezer en ontdooi de monsters. Pipetteer de vloeistof een paar keer op en neer om de bacteriën uit de darm te scheiden. Voer PCR uit met behulp van universele primerparen tegen de DNA-sequentie van de kleine ribosomale subeenheid van bacteriën, gist of microsporidia, afhankelijk van het vermoedelijke type microbe.OPMERKING: Een voorbeeldprotocol met universele bacteriële 16S-primers wordt bijvoorbeeld weergegeven in tabel 1. Zuiver het amplicon met behulp van een op filters gebaseerde DNA-reinigings- en concentratiekit (zie Materiaaltabel) en voer Sanger-sequencing uit.

Representative Results

Een wilde C. tropicalis-stam (JU1848) werd geïsoleerd uit rotte palmboomvruchten in het Nouragues-bos van Frans-Guyana (figuur 1A)24. Deze stam bleek dunne microben te hebben die het lumen van de darm op een directionele manier koloniseren (figuur 1B). Deze microbe werd gemakkelijk overgebracht naar C. elegans stam N2 via co-kweek met stam JU1848, waar het het lumen van de darm op dezelfde manier koloniseerde. Vermeerdering van JU1848 op standaard NGM-platen gezaaid met E. coli OP50-1 gedurende meerdere generaties resulteerde voortdurend in zichtbare besmetting, gezien als verschillende donkere, mucoid kolonies op en naast het OP50-1 gazon (figuur 2A). Een bord wilde JU1848 werd uitgehongerd om dieren in dauer te dwingen en schoongemaakt zoals beschreven. Single dauer-dieren die het schoonmaken overleefden, werden op individuele NGM-platen van 6 cm gezaaid met OP50-1 en mochten gedurende 4 dagen groeien bij 20 °C. Meerdere platen van F1-nakomelingen werden waargenomen zonder zichtbare microbiële besmetting (figuur 2B). Van de F1-nakomelingen werd geverifieerd dat ze nog steeds aanhangende bacteriën bevatten in het lumen van de darm (zie hieronder). Schone JU1848-dieren werden gewassen en onthoofd om darmstukken te isoleren zoals beschreven in het protocol (stappen 6.1-6.12). Aanhangende bacteriën in het lumen van de ontlede darm werden geverifieerd via Nomarski-microscopie (figuur 3). De microbe in het lumen van JU1848 werd ervan verdacht een bacterie te zijn, dus de ontleedde darmen werden gebruikt als sjabloon voor PCR met behulp van universele bacteriële 16S-primers, 27F en 1492R. Uit in totaal zes individuele ontleedde darmen werden de PCR-producten gesequenced via Sanger, en schone chromatografen toonden aan dat alle zes sequenties identiek waren. Op basis van deze sequenties werd deze bacterie geïdentificeerd als een nieuwe soort in de klasse Alphaproteobacteria, maar kon niet worden ingedeeld in een bekende orde of geslacht (Aanvullend Bestand 1). Figuur 1: Aanhangende bacteriën die het lumen van een wilde C. tropicalis koloniseren. (A) Veldmonsterbeeld van rotte Euterpe sp. (Familie: Arecaceae) palmboomvruchten in het Nouragues-bos van Frans-Guyana. (B) Nomarski-afbeelding van stam JU1848 gezien met duizenden lange, dunne bacteriën die een borstelachtig uiterlijk vormen in het lumen (lu) van de gastheerdarm (in). De bacteriële (ba) lagen die de darm bedekken zijn aangegeven met haakjes ([). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Verontreinigende microbiële groei gaat verloren na reiniging van nematoden. (A) Wilde stam JU1848 vermeerdert merkbare microbiële groei op standaard 6 cm NGM-platen gezaaid met E. coli OP50-1-bacteriën. (B) Na reiniging vertoont een plaat F1-nakomelingen van een enkele dauer geen zichtbare microbiële besmetting na 4 dagen incubatie bij 20 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Aanhangende bacteriën worden gezien in het lumen van de ontlede darm. Nomarski-afbeelding van een schoon JU1848-dier dat werd onthoofd zodat de darmen eruit vloeien. De koloniserende bacteriën (ba) zijn geïndiceerd met een beugel ([) en worden gezien in het lumen (lu) van een stuk van de darm (in) dat zich buiten het nematodenlichaam bevindt (nb). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Reagens Concentratie Aantal 27F primer (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) 20 meter 2,5 μL 1492R primer (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 20 meter 2,5 μL Ontleedde darm in water N.V.T 3 μL 10x PCR-buffer 10x 5 μl DNTP 10 meter 1 μl Taq Polymerase 5 u/μl 0,5 μL Water N.V.T 35,5 μL Tabel 1: Voorbeeld PCR-protocol met universele bacteriële primers en ontleedde darm. Aanvullend bestand 1: MUSCLE-uitlijning van bacteriële 16S rDNA-sequenties afgeleid van PCR van zes ontlede JU1848-darmen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit protocol beschrijft de isolatie en identificatie van microben van in het wild geïsoleerde Caenorhabditis-nematoden met behulp van een reeks reinigingsprocedures. Talrijke microben worden geassocieerd met wild-geïsoleerde nematoden, en sommigen van hen hebben opwindende fenotypes die kunnen worden gebruikt voor toekomstige studies in gastheer-microbe interacties en aangeboren immuniteit. Veel kweekbare microbioom en pathogene bacteriën zijn geïsoleerd uit wilde Caenorhabditis-nematoden met behulp van standaardtechnieken voor in vitro bacteriegroei25,26. Niet alle microben kunnen echter in vitro worden gekweekt en het wordt noodzakelijk om ze te verrijken met wilde nematoden. Sommige microben hebben een resistent sporenstadium, zoals microsporidia, en hoge concentraties SDS kunnen worden gebruikt om de meeste bacteriën en schimmels te doden, waardoor specifieke verrijking van sporen mogelijk is12. Dit protocol presenteert een methode om niet-kweekbare darmmicroben te verrijken die niet resistent zijn tegen SDS en antibioticabehandeling.

De hier gepresenteerde techniek maakt gebruik van de omgevingsweerstand die wordt gezien bij dauerdieren als gevolg van fysiologische veranderingen zoals versterking van de cuticula, het onderdrukken van faryngeaal pompen en het bedekken van de mond met een buccale plug27. Een cruciale stap in dit protocol is de nachtelijke incubatie met verschillende antibiotica en 0,25% SDS. Deze stap wordt gebruikt om alle externe microben te doden terwijl interne microben intact blijven. Hoewel is aangetoond dat C. elegans dauers SDS-concentraties zo hoog overleven bij 10% gedurende 30 min27, gebruikt dit protocol een matige maar langdurige incubatie om niet alleen microben te doden, maar bacteriën ook verder bloot te stellen aan antibiotica. Bovendien kan een matige concentratie SDS ervoor zorgen dat dauers van andere Caenorhabditis-soorten overleven, aangezien blootstelling van C. tropicalis aan 1% SDS ‘s nachts resulteerde in de dood van alle dauerdieren. Als alle dauers sterven, moet de concentratie van SDS en/of de duur van de blootstelling aan SDS worden verminderd. Omgekeerd, als de F1-generatieplaten na reiniging nog steeds zichtbare vervuiling hebben, moeten de SDS-concentratie en incubatietijd worden verhoogd.

Een andere cruciale stap is de isolatie van enkele dauerdieren na het schoonmaken. Deze stap is cruciaal omdat niet alle dieren schoon zijn na SDS en antibioticabehandeling. Daarom worden de dieren in het midden van een 10 cm NGM-plaat met OP50-1 geplaatst en mogen ze radiaal naar buiten kruipen. Vaak is het het beste om meer distale dieren te plukken, omdat langdurig kruipen door OP50-1 lijkt te helpen bij het verwijderen van mogelijke overlevende microben die aan de cuticula zijn bevestigd. Dit leidt echter tot een beperking van het protocol, omdat het moeilijker zal zijn om te verrijken voor een microbe van belang als deze niet met een hoge frequentie in de populatie aanwezig is. Hier was de aanhangende Alphaproteobacteria aanwezig in 90%-95% van de bevolking; daarom hadden de meeste schone platen de microbioombacterie. Als een microbe van belang echter met een veel lagere frequentie in de populatie aanwezig is, kan het nodig zijn om veel meer F1-platen te screenen.

Dit protocol kan waarschijnlijk worden gebruikt om een willekeurig aantal niet-kweekbare microben van belang te isoleren die worden aangetroffen in wilde nematoden. De microbe moet zich echter in een weefsel bevinden dat wordt beschermd door de dauer-cuticula, in staat is om te overleven bij dauerdieren en een waarneembaar fenotype in de gastheer heeft. Als zodanig kan deze techniek worden gebruikt om andere microbioombacteriën in het darmlumen te verrijken naast de hier beschreven Alphaproteobacteria-soorten, inclusief bacteriën die zich niet hechten. Ook werd het protocol gebruikt om te verrijken voor een facultatieve intracellulaire bacterie, Bordetella atropi, die de nematode Oscheius tipulae28 infecteert. Na verrijking bleek B. atropi kolonies te vormen op NGM-platen, waaruit blijkt dat een microbe van belang kan worden ontdekt om in vitro te kwellen zodra sneller groeiende verontreinigingen zijn verwijderd. Deze techniek zou waarschijnlijk werken voor microsproidians en virussen, waaronder het Orsay-virus, gezien dit vermogen om een intracellulaire bacterie te verrijken. Deze microben moeten echter in staat zijn om de overgang in en uit dauer te overleven.

Het is belangrijk om te onthouden dat hoewel dit protocol kan worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 1-laboratorium, een steriele techniek overal moet worden gehandhaafd om verdere microbiële besmetting te voorkomen. Het protocol kan worden gewijzigd op basis van de behoeften van de onderzoeker, inclusief de soorten / concentraties antibiotica, het percentage SDS en / of de toevoeging van antischimmelmiddelen zoals nystatine. Vaak kan het aantal besmettende microben in een in het wild geïsoleerde nematode dramatisch variëren. Hier werd het schijnbare verlies van niet-OP50-1 E. coli-groei op NGM-platen gebruikt als uitlezing voor een schone nematodenstam. Maar er kunnen niet-kweekbare populaties van contaminerende microben aanwezig zijn, dus het is essentieel om een metagenomics-methode uit te voeren, zoals 16S rRNA-amplicon-sequencing om de mate van besmetting te zien26. Zodra de wormstam is gereinigd, kan deze worden ingevroren en opgeborgen voor toekomstige studies. Over het algemeen stelt dit protocol onderzoekers in staat om niet-culturele microben in wilde nematoden te verrijken, waardoor ze effecten op de fitheid van de gastheer kunnen bestuderen, fenotypen van kolonisatie of infectie kunnen karakteriseren en kunnen profiteren van genetische hulpmiddelen om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan interacties tussen gastheer en microbe.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dank aan Dr. Christian Braendle en het Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues Field Station.

Materials

Agarose Fisher Scientific BP1356
10% SDS Invitrogen AM9822
BD PrecisionGlide Needle – 26 G Fisher Scientific 305115
Carbenicillin Millipore-Sigma C1389-1G
Cefotaxime Millipore-Sigma C7039-500mg
Chloramphenicol Millipore-Sigma C0378-25G
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research 11-303C
DreamTaq Polymerase Fisher Scientific EP0711
Gentamycin Millipore-Sigma G1264-250mg
Kanamycin Millipore-Sigma K1876-1G
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Streptomycin Millipore-Sigma S6501-50G
Tetracyclin Millipore-Sigma T7660-5G
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Watch glasses VWR 470144-850
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15, 1313-1322 (2013).
  2. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24, 3-9 (2012).
  3. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Biologia do Desenvolvimento. 268, 448-456 (2004).
  4. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377, 383-396 (2019).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  6. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8215-8220 (2014).
  7. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 10, 1004200 (2014).
  8. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIG-I Homolog DRH-1 Mediates the Intracellular Pathogen Response upon Viral Infection. Journal of Virology. 94, 01173 (2020).
  9. Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15, 833-838 (2014).
  10. Félix, M. -. A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10, 59 (2012).
  11. Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology and Evolution. 5, 794-807 (2021).
  12. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
  13. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28, 640-648 (2018).
  14. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9, 1000586 (2011).
  15. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
  16. Félix, M. -. A., Wang, D. Natural viruses of Caenorhabditis nematodes. Annual Review Genetics. 53, 313-326 (2019).
  17. Grover, M., Barkoulas, M. C. elegans as a new tractable host to study infections by animal pathogenic oomycetes. PLoS Pathogens. 17, 1009316 (2021).
  18. Bakowski, M. A., Luallen, R. J., Troemel, E. R. Microsporidia Infections in Caenorhabditis Elegans and Other Nematodes. Microsporidia: Pathogens of Opportunity: First Edition. , (2014).
  19. Taffoni, C., Pujol, N. Mechanisms of innate immunity in C. elegans epidermis. Tissue Barriers. 3, 1078432 (2015).
  20. Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10, 3025-3039 (2020).
  21. Frézal, L., Félix, M. -. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  22. Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 2736-2752 (2008).
  23. Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Characterization of microsporidia-induced developmental arrest and a transmembrane leucine-rich repeat protein in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 10, 0124065 (2015).
  24. Félix, M. -. A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13, 10 (2013).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Androwski, R. J., Flatt, K. M., Schroeder, N. E. Phenotypic plasticity and remodeling in the stress-induced C. elegans dauer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 278 (2017).
  28. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Félix, M. -. A., Luallen, R. J. Bacterial filamentation is an in vivo mechanism for cell-to-cell spreading. bioRxiv. , (2021).

Tags

CaenorhabditisNematodesMicrobiomeEnrichmentIntestinal MicrobiomeUnculturable MicrobesOP51 Escherichia ColiDauer StageM9 Minimal Salts MediaTriton X-100AntibioticSDS Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M., Luallen, R. J. Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria. J. Vis. Exp. (174), e62937, doi:10.3791/62937 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image